猪圆环病毒2型滨州分离株全基因组的克隆与序列分析

张文通，李 峰，魏 凤，苗立中，吴家强，沈志强，，＊

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600；3.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南250100）

猪圆环病毒病（Porcine circovirus disease，PCVD）是由猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV-2）感染引起猪的传染病。PCV-2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的重要病原，主要感染5周龄～12周龄仔猪。病猪主要特征为体质下降、消瘦、腹泻及呼吸困难［1］。PCV-2对养猪业最大的危害是能破坏感染猪的免疫系统，造成免疫抑制，使感染猪对多种病原的易感性增强［1-2］。由PCV-2引起的猪只感染已相当普遍，是给养猪业造成巨大经济损失的重大传染病之一［3-5］。目前，关于PCV-2的研究，已成为畜牧兽医领域科研工作者研究的焦点之一。

近年来，关于PCV-2基因组存在差异的文献不断增多，不同地区分离的PCV-2存在遗传变异［3-12］。因此，开展对PCV-2地方分离株的基因组序列分析，弄清其遗传变异情况，将有助于PCV-2的防控。

本研究对来自滨州3个不同区域（滨州滨城区、滨州惠民县和滨州沾化县）疑似感染猪圆环病毒病的猪场病猪病料进行PCR，结果均为阳性。初步诊断这3个猪场均存在PCV-2感染。利用PCR技术对这3个猪场病料分别进行PCV-2全基因组的克隆及测序，得到这3个猪场的PCV-2基因组序列。分别将从滨州滨城区、滨州惠民县和滨州沾化县某猪场病料中得到的PCV-2全基因组，分别命名为BZ-1、BZ-2和BZ-3。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 3份疑似PCVD病料分别来自滨州滨城区、滨州惠民县和滨州沾化县某养猪场病死猪，病料均为无菌采集的病死猪淋巴结及肺脏。

1.1.2 主要试剂 基因组DNA提取试剂盒，北京百泰克生物技术有限公司产品；TaKaRa ExTaq、10× ExTaqbuffer、dNTP Mixture、pMD18-T 载体、BamHⅠ、HindⅢ，宝生物工程（大连）有限公司产品；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司产品；大肠埃希菌DH5α菌种由山东省滨州畜牧兽医研究院保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 参照文献［13］由上海生工生物工程技术服务有限公司合成PCV-2检测引物，PCR扩增核苷酸预期为1 154bp。引物序列为：P1：5′-CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3′；P2：5′-ACCCCCGCCACCGCTACC-3′；参 照 GenBank 公布的PCV-2HN株（HM038021）设计一对用于扩增全基因组的引物，引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列为：P3：5′-TTTGGATCCGCTGGCTGAACTTTTGA-3′； P4：5′-AGCGGATCCAAATTTCTGACAAACGTTACA-3′。

1.2.2 疑似PCV-2感染病料的PCR鉴定 将无菌采集的病料组织，按照1∶3比例添加灭菌的8.5g／L氯化钠溶液，用匀浆器进行研磨；悬液反复冻融3次；然后以12 000r／min离心；上清用0.22 μm滤器过滤除菌并保存备用。过滤后的菌液一部分用作提取DNA基因组的模板。

取部分滤液用试剂盒提取基因组DNA，具体操作按试剂盒说明书操作。以该基因组为模板，用P1和P2引物进行PCR扩增。PCR扩增25μL体系，具体为：10× ExTaqbuffer 2.5μL，dNTP Mixture（20mmol／L）1μL，P1和 P2（引物浓度均20 μmol／L）各0.5μL，TaKaRa ExTaq0.5μL，模板DNA 5μL，添加灭菌水至25μL。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，62℃45s，72℃45s，35个循环；72℃10min。扩增产物用8g／L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 PCV-2全基因组PCR扩增、克隆、鉴定及序列分析 以1.2.2获得的基因组DNA为模板，用P3和P4引物进行PCR扩增。PCR扩增25μL体系，具体为：10 × ExTaqbuffer 2.5μL，dNTP Mixture（20mmol／L）1μL，P3和 P4（引物浓度均20μmol／L）各0.5μL，TaKaRa ExTaq0.5μL，模板DNA 5μL，添加灭菌水至25μL。PCR反应条件为：94℃5min；94 ℃ 1min，56 ℃ 1min，72 ℃ 1 min 30s，35个循环后；72℃10min。扩增产物用8g／L琼脂糖凝胶电泳检测。

将扩增的PCR产物用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书操作。将回收到的PCR产物，连接到pMD18-T载体上，连接后的产物（滨州滨城区、滨州惠民县、滨州沾化县各PCR产物连接pMD18-T载体的连接产物，分别标记为pT-BZ-1、pT-BZ-2、pT-BZ-3）经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定正确后，送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。用DNA Star软件对测序结果与GenBank上公布的PCV-2基因核苷酸序列及氨基酸同源性分析，并绘制核苷酸序列遗传进化树。

2 结果

2.1 疑似PCV-2感染病料的PCR鉴定结果

疑似PCV-2感染病料的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增到了与预期大小1 154bp相符的片段，结果见图1。根据PCR鉴定结果初步判定来自3个猪场的病料均为PCV-2阳性。

2.2 病料中PCV-2的全基因组扩增及重组质粒鉴定结果

病料中PCV-2全基因组PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增到了与预期大小1 767bp相符的片段，结果见图2。连接产物pT-BZ-1、pT-BZ-2、pT-BZ-3经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产物经琼脂糖电泳检测获得了约1 800bp和2 600bp的片段，证实连接正确，结果如图3所示。

图1 PCV-2的PCR结果Fig.1 PCR results of PCV-2

图2 PCV-2全长基因组PCR结果Fig.2 PCR results of PCV-2full-length genome

图3 克隆质粒双酶切鉴定结果Fig.3 Identification results of cloning plasmids by double enzyme digestion

2.3 PCV-2全基因组同源性比较及遗传进化分析

利用DNA Star软件，将BZ-1、BZ-2及BZ-3的PCV-2全基因组测序结果与GenBank上公布的GU938303、GU938304、、HQ113120、HQ113121、HQ113117、 JN176181、 JX193799、 JX204386、HQ113119、KM245558、JX519293、 KJ956690、GU938302、KM460823毒株全基因组序列进行核苷酸同源性比较。图4显示BZ-1株与GU938302株同源性最近（99.9%），与 HQ113120、JX193799同源性同源性最远（均为 95.9%），BZ-2 株 与KJ956690株同源性最近（99.8%），与JX204386同源性同源性最远（95.6%），BZ-3株与JN176181株同源性最近（99.8%），与JX193799同源性同源性最远（95.9%）。

图4 PCV-2全基因组核苷酸同源性比较结果Fig.4 Homology comparison of the nucleotide of PCV-2genomic sequences

利用 MEGA 3.1软件，绘制BZ-1、BZ-2及BZ-3与 GenBank上 公 布 的 GU938303、GU938304、HQ113120、HQ113121、HQ113117、JN176181、JX193799、JX204386、 HQ113119、 KM245558、JX519293、KJ956690、GU938302、KM460823PCV-2毒株全基因组核苷酸遗传进化树，结果如图5所示。图5显示BZ-1株与BZ-3株处在同一分支，而BZ-2株处在另一分支。

图5 PCV-2全基因组核苷酸遗传进化树Fig.5 Phylogenetic tree of nucleotide of PCV-2 full-length genome

3 讨论

PCVD是危害养猪业的重要传染病之一，自1991年加拿大科学家首次报道本病以来，各个养猪大国相继都有本病的报道，该病具有世界范围流行的特点。GenBank上公布的PCV-2基因组大小有1 766、1 767、1 768bp 3种［10］。PCV-2通常含有11个阅读框，其中编码ORF2蛋白的核苷酸长度为702bp或705bp［10］。本研究的3个PCV-2分离株即BZ-1、BZ-2、BZ-3全基因长度均为1 767bp；BZ-1和BZ-3PCV-2分离株编码ORF2基因核苷酸长度均为705bp，而BZ-2PCV-2分离株编码ORF2基因核苷酸长度均为702bp。BZ-1和BZ-3PCV-2分离株编码ORF2氨基酸同源性为99.6%，仅在169位有差异，其中BZ-1为R、BZ-2为G；而BZ-1、BZ-3与BZ-2PCV-2分离株编码ORF2氨基酸同源性为94.9%，差异较大，尤其是在免疫活性表位113-136为发生变异。

关于PCV-2分离株变异报道的文献逐渐增多，PCV-2按照基因型分为PCV-2a、PCV-2b、PCV-2c、PCV-2d、PCV-2e［7-12］。中国存在 PCV-2a、PCV-2b、PCV-2d，其中 PCV-2b是优势基因型［3-6］。PCV-2核苷酸遗传进化树结果BZ-1、BZ-2、BZ-3 3个PCV-2分离株基因组均为PCV-2b基因型（GenBank显示，HQ113121、HQ113120、JX193799、HQ113117、HQ113119等均为PCV-2b基因型）。

与BZ-1分离株同源性最近的GU938302毒株为2009年河南南阳分离株，与BZ-2分离株同源性最近的KJ956690毒株为2014年华南地区分离株，与BZ-3分离株同源性最近的JN176181毒株为2010年天津分离株。天津和河南均与山东相邻，而华南区域与山东相隔较远，这说明滨州区域流行的PCV-2毒株具有广泛性。本研究对滨州相关区域进行PCVD疫苗防控提供了理论依据。

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