高效液相色谱法在乳制品三聚氰胺含量检测中的应用浅析

朱晓晨（上海实力可商品检验有限公司,上海200231）

高效液相色谱法在乳制品三聚氰胺含量检测中的应用浅析

朱晓晨
（上海实力可商品检验有限公司,上海200231）

摘要：建立一个快速有效的样品预处理方法，利用高效液相色谱仪，建立一个快速、有效、灵敏、准确并具有非常良好的可重复性的高效液相检测方法，检测乳制品中的三聚氰胺的含量。方法：利用HPLC，在240nm的波长处，对乳制品中的三聚氰胺的含量进行检测。结果：高效液相色谱法检测乳制品中三聚氰胺的含量的方法有很好的准确度和精确度，而且该方法操作方便、快速。结论：为了保证乳制品的安全可食用，需要准确而快速的对乳制品中的三聚氰胺含量进行检测。利用高效液相色谱法可以既准确又快速的检测出乳制品中三聚氰胺的含量，为乳制品的安全保驾护航。

关键词：三聚氰胺；乳制品；高效液相色谱法

0引言

三聚氰胺(melamine)简称三胺，为白色晶体粉末。俗称又为蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。在水中的溶解度很低，并且其水溶液呈弱碱性，不溶于C2H5OC2H5，C6H6和CCl4。能溶于甲醇、乙腈、乙酸、甲醛等有机溶剂。三聚氰胺能被各种酸酸化，生成三聚氰胺盐。

在传统食品工业上，通常采用凯氏定氮法测量蛋白质含量，这种方法的缺陷是只能测出食品中氮的含量，不能测出氮的来源和种类。蛋白质中氮的含量是16%，三聚氰胺中氮的含量是66%，因此三聚氰胺被一些不法商家利用，将其添加进食品中，造成食品含有高蛋白的假象，在乳制品中尤是如此。三聚氰胺被人体吸收后，在人体中发生分解反应，得到产物三聚氰酸，三聚氰胺和三聚氰酸结合形成网状体，在人体中生成结石，对人体造成危害。

在2007年，美国发生了几起猫、狗的不明中毒死亡事件，经调查发现，根源是宠物食品中违规添加了三聚氰胺。2008年，我国发生了震惊国人的“毒奶粉”事件，其根本原因是不法商家在患儿使用的奶粉中添加了三聚氰胺。政府部门也在积极应对三聚氰胺食品安全事件，全国的各个食品检测机构均努力研发各种行之有效的检测方法，并出台了各项检测标准：GB/T22388-2008GB/T22400-2008GB/T22288-2008等。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1̓主要仪器

2695/2487含有柱温箱和紫外检测器的高效液相色谱仪（美国Waters公司）；TTL-DCⅡ氮吹仪（北京同泰联科技有限公司）；HI850R高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；WIGGENSVortex3000漩涡混合器（北京桑翌实验仪器研究所）；超声提取仪（上海比朗仪器制造有限公司）；阳离子交换固相萃取柱（60mg/3mL）（北京华盛谱信仪器有限责任公司）。

1.1.2̓主要试剂

三聚氰胺标准品（Sigma公司）；甲醇（色谱级）；乙腈（色谱级）；超纯水（色谱级）；氨水（浓度为25%~28%）；三氯乙酸（10g/L）；乙酸铅溶液（22g/L）。

1.2实验方法

1.2.1̓提取液配制

量取480ml浓度为10g/L三氯乙酸溶液，向其中加入20ml浓度为22g/L的乙酸铅溶液。

1.2.2̓氨化甲醇溶液配制

取5ml氨水用甲醇定容至1L。

1.2.3̓流动相的配制

称量庚烷磺酸钠2.02g，柠檬酸2.10g，与1L的容量瓶中，用超纯水定容至1L。量取900ml该溶液与100ml乙腈混合。

1.2.4̓标准贮备液配制

量取200ml甲醇溶液，用超纯水稀释至1000ml，得到20%（v/v）溶液。称取100mg三聚氰胺标准品于100ml容量瓶中，用配制好的20%（v/v）溶液定容至100ml，终浓度为1mg/ml。储存在4℃冰箱中，可有效保存3个月。

1.2.5̓标准工作液配制

量取适量三聚氰胺贮备液，以20%（v/v）的甲醇溶液将其稀释为1.0、5.0、10、25、50μg/L，储存在4℃冰箱中，可有效保存1周。1.2.6̓样品的预处理

将乳制品混匀，然后称取2.00g于50ml离心管中，加入提取液稀释至20.0ml，涡旋处理30s，超声处理20min，然后静止2min，在在10000rpm离心5min。

1.2.7̓净化

分别量取3ml甲醇和3ml超纯水，对混合型离子交换固相萃取柱进行活化。精确量取10.0ml离心上清液，然后分批上柱，将过柱流速稳定在1ml/min。然后用3ml超纯水洗涤涤混合型阳离子交换固相萃取柱，接着继续用3ml甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，将洗涤液吹干后，再取3ml氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，置于氮吹仪上，用50℃氮气吹干。用移液管取1.0ml200ml/L甲醇溶液将残留样品溶解，涡旋1min，用孔径为0.45μm滤膜过滤，用高效液相色谱法进行测定。

1.2.8色谱条件

色谱柱：C18柱，150*4.6mm，5μm，柱温30℃，流速1.0ml/ min，进样量20μL。流动相：见方法。

1.2.9̓检测

以保留时间为准进行定性，试样的保留时间和标准品的保留时间要小于2%。定量测定采用单点或者多点外标法。乳制品样品中三聚氰胺的峰面积在标准曲线的范围内。

1.2.10̓工作曲线以及三聚氰胺含量计算

C表示样品中三聚氰胺的含量，以质量分数表示，单位是毫克每千克（mg/kg），单点校正的公式：C=A*CS*V1*V3*1000/ AS*M*V2*1000；

式中：AS指的是液相色谱峰型的面积；A指的是样品溶液对应的色谱峰面积；CS指的是三聚氰胺标准品溶液的浓度（μg/ml），V1和V2分别指的是提取液的体积和过柱体积，单位是mL，M是进样量，单位是g。

2结果

2.1净化条件的确定

三聚氰胺是碱性物质，因此在该实验中，使用OasisMCX固相萃取柱净化，OasisMCX固相萃取柱能有效的留住碱性物质，并能将乳制品样品中的杂质去除，本实验中，以低浓度的氨水为洗脱液，可以最大程度上降低萃取柱对碱性样品中杂质的吸附。尽可能消除杂质对试验结果的干扰。将5ml氨水用甲醇溶解至100ml得到50ml/L的氨化甲醇溶液，当三聚氰胺通过OasisMCX固相萃取柱后，用氨化甲醇溶液洗脱，三聚氰胺的回收率能达到99%。

2.2液相条件的确定

三聚氰胺属于极性非常强的有机物，通过反相C18柱时，几乎没有保留，为了更好的进行色谱分离，形成有效、清晰的色谱峰，以乙腈和的0.01moL/L庚烷磺酸钠及柠檬酸离子缓冲液为流动相，调节两者之间的比例进行试验（1：9和6：94）以缩短分离时间，增强分离效果。经过比较发现，当比例为6：94时，三聚氰胺在240nm紫外下检测，呈现较大的吸收峰，分离效果比较理想。

2.3液相方法的分离范围

配制浓度一定浓度梯度的三聚氰胺标准品溶液，浓度分别为0mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L、0.5mg/L、0.80mg/L、1.00mg/L，利用前述的液相设备和条件，检测这一系列浓度梯度的三聚氰胺标准品溶液，结果表明，在上述浓度范围内，三聚氰胺的浓度与色谱峰面积呈现良好的线性关系，规定本实验的检测限为0.5mg/kg，定量限为1mg/kg，所以，如果乳制品样品中的三聚氰胺的含量低于0.5mg/kg，则视为不含三聚氰胺，一旦检测结果显示三聚氰胺的含量高于0.5mg/ kg，则视为乳制品中添加了三聚氰胺，需要向质监局报告。

2.4回收率和精度

利用上述色谱条件，对乳制品样品进行检测，同时设置空白和平行试验，平行试验的量都是1mg/kg，遵照规定的试验流程进行操作，对样品进行处理，然后依据上文给出的公式计算三聚氰胺的含量和回收率，结果显示，该色谱条件的平均回收率分别是为89.9%和90.1%。

2.5该色谱方法的实际应用

2008年9月份和10月份，分别采集某市14家具备一定规模的奶牛养殖基地。以上述建立的色谱方法对采集到的乳制品样品进行检测，结果发现，有一家奶牛场生产的乳制品中三聚氰胺的含量为0.587mg/ kg，超出了最低检测限，然后我们对该样品进行了10次平行检测，结果不变，因此可以认为该奶牛场生产的乳制品存在违规添加三聚氰胺的行为，需要报告至质监局。

3结语

乳制品的传统检测，采用的是凯氏定氮法，该方法通过检测氮的含量，来确定乳制品中蛋白质的含量，不法商家利用该漏洞，添加含氮量高的三聚氰胺，以造成蛋白含量高的假象。

利用本文建立的液相色谱方法对乳制品中的三聚氰胺进行检测，结果表明本文建立的方法具有稳定的净化效果，且检测限很低，方法的可重复性好，回收率高且稳定，回收率均在89%以上，检测方便，具备很强的可操作性。能检测到含量在检测限0.5mg/kg以下的乳制品中三聚氰胺的含量，这样基本上保证了三聚氰胺添加行为不再漏网。

参考文献：

[1]梁剑，钟茂生，朱品玲，陈舒奕.水产品中三聚氰胺含量的快速检测方法研究[J].安徽农业科学,2009(28):3446-3447+3472.

[2]田玉平，王虎，蒋和平.高效液相色谱法测定乳及乳制品中三聚氰胺含量的不确定度评定[J].实验室研究与探索,2010(01):41-43.

[3]李娜思.超高效液相色谱—串联质谱法在牛奶抗生素残留及双氰胺检测中的应用[D].华东理工大学,2014.

[4]刘震.鲜乳制品中三聚氰胺的高效液相色谱法检测[J].科技创新与应用，2012(01):27.