高效液相法检测细胞内嘌呤含量研究①

刘慧东，李锦莲，武冬梅

(1.黑龙江省开拓辐射技术开发公司，黑龙江 哈尔滨 150001；2.佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007)

高效液相法检测细胞内嘌呤含量研究①

刘慧东1，李锦莲2，武冬梅2

(1.黑龙江省开拓辐射技术开发公司，黑龙江 哈尔滨 150001；2.佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的：改进细胞收集方法以提高高效液相法检测细胞内嘌呤的效率。方法：采用高效液相法检测原位和传统两种收集方法获得的细胞质。结果：原位收集获得的MCF-7细胞质中黄嘌呤，次黄嘌呤，腺嘌呤浓度均高于传统收集细胞法获得的MCF-7细胞质相应的嘌呤浓度。结论：与传统的细胞收集法相比，原位细胞收集法更能得到含量较高的嘌呤。

高效液相法；嘌呤；MCF-7细胞

嘌呤是核苷酸代谢中间产物，细胞内嘌呤含量的检测对核苷酸代谢相关生理、病理过程的研究有重要意义[1～3]。高效液相(HPLC)法是经典的定量检测方法[4～6]，然而此法目前采用的细胞收集和前处理方式复杂，所需细胞大，不仅造成检测价格昂贵，而且所需时间较长，易造成检测信号的丢失，因此改进细胞前处理方式，提高信号强度，缩短前处理时间，以便节省细胞培养，保证检测的精确度，具有重要意义。本文改进了原始的细胞需要消化、离心、重悬、裂解的收集过程，直接在培养皿中原位裂解收集，大大缩短了实验操作时间，降低了细胞收集所需费用。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

安捷伦1100高效液相色谱仪，美国；HH.CP-T型二氧化碳培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；人乳腺肿瘤细胞MCF-7，东北林业大学赠送；优级胎牛血清、DMEM培养基、链霉素和青霉素，Gibco公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 MCF-7细胞的培养和收集

MCF-7细胞加适量DMEM培养液，置37℃、5% CO2、100%饱和湿度的培养箱中培养。将生长状态良好且长满培养皿底的MCF-7细胞按下述两种方法收集。

传统细胞收集法：将细胞依次进行消化、吹打悬浮、离心(1000 r·min-1，10 min)后得细胞沉淀，所得细胞沉淀用pH 7.4 PBS溶液冲洗3次，然后用适量的pH 7.4 PBS溶液配成细胞悬液并计数。所得细胞悬液在水浴50℃作用30 min后获得待测细胞质。

原位细胞收集法：将生长状态良好且长满培养皿底的细胞用PBS清洗3次，加入适量的pH 7.4 PBS在水浴50℃作用30min后获得待测细胞质。

1.3 HPLC测试条件

Ascenis RP-Amide 柱(250mm×4.0mm ID，5.0μm)；DAD检测器；检测波长为254 nm；流动相为的磷酸二氢钾溶液，pH=4.0；流速为1.0mL·min-1。

2 结果与讨论

2.1 原位法与传统法收集MCF-7细胞质内嘌呤HPLC法检测

图1为HPLC法检测原位收集的MCF-7细胞质中嘌呤碱基信号峰。并与传统收集过程做了比较。原位收集的MCF-7细胞质(图1-a)高效液相色谱信号峰明显大于传统收集的MCF-7细胞质信号峰(图1-b)。

图1 HPLC检测原位收集获得的MCF-7细胞质中电活性物质的含量 (a)原位收集MCF-7细胞，(b)传统收集法MCF-7细胞 细胞浓度：2.0×106 cells·mL-1

2.2 HPLC法测定嘌呤碱基标准曲线

见图2。如图2所示，随着嘌呤浓度的增加，高效液相色谱法检测的峰面积也随着增加，并在0.5～100.0μg·mL-1的范围内呈现良好的线性关系。鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤和腺嘌呤的线性方程线性关系分别为Sguanine=10.3 Cguanine(μg·mL-1)，R=0.999；Sxanthine=21.68 Cxanthine (μg·mL-1)-8.923，R=0.999；Sxanthine= 17.55 Cxanthine (μg·mL-1)-12.593，R=0.999；SAdenine=32.58 CAdenine(μg·mL-1)-3.879，R=0.999。

图2 嘌呤浓度与HPLC峰面积的关系 (A)鸟嘌呤，(B)黄嘌呤，(C)次黄嘌呤，(D)腺嘌呤

2.3 HPLC法测定原位法和传统法收集细胞内嘌呤含量比较

见表1～2。

表1 细胞收集方法对HPLC峰面积的影响

由表1可见，原位收集的MCF-7细胞质中次黄嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤的峰面积分别为124.6，84.0和157.0，与传统收集法的峰面积相比，其峰面积分别相对增长8.6，6.1和7.4，相对增长比例分别为7.4 %，7.8 %和4.9 %。而原位收集的MCF-7细胞质中鸟嘌呤的峰面积由28.2相对减少了10.3，其相对减少的比例达25.2 %。

表2 HPLC检测MCF-7细胞质中嘌呤的浓度

表2描述的是细胞收集方法对细胞质内嘌呤浓度的影响。结果表明，原位收集获得的MCF-7细胞质中黄嘌呤，次黄嘌呤，腺嘌呤3种嘌呤浓度均高于传统收集细胞法获得的MCF-7细胞质相应的嘌呤浓度，但鸟嘌呤浓度低于传统收集细胞法获得的MCF-7细胞质，引起这种现象的原因目前还无法解释，仍需进一步的实验研究才能确定。

3 结论

采用HPLC法检测细胞内嘌呤的含量，从次黄嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤的峰面积角度考虑，原位收集法>传统收集法。说明与传统的细胞收集法相比，原位细胞收集法更能得到含量较高的嘌呤。

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[2]D M Wu, G L Fu, L Hu, et al. Studies on the origin of the voltammetric response of the PC-3 cell suspension [J]. Talanta，2009, 78(2): 602-607

[3]J T Wang, X E Li, Y Zhang, et al. Voltammetric behavior of the MCF-7 cell cytoplasm and the effect of taxol on voltammetric response[J].Analytical Biochemistry，2009, 394(2): 229-236

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Study of detection of purine cellular by HPLC method

LIUHui-dong1,LIJin-lian2,WUDong-mei2

(1.Heilongjiang Kaituo Radiation Technology Development Company,Haebin 150001，China;2.College of Pharmacy of Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

Objective: To improve the method of cell collection for promotion efficiency of detection purine cellular by HPLC method. Methods: HPLC methodis adopted to detect cytoplasm collected by in situ and traditional methods. Results: The concentrations of xanthine, hypoxanthine and adenine collecting by in situ method were more than that by tradition method. Conclusion: Compared with the tradition collection method, in situ collection method was more effective.

HPLC method; purine; MCF-7 cell

黑龙江省教育厅科学研究项目，编号：12511542。

刘慧东(1963～)女，黑龙江哈尔滨人，大专，工程师。

武冬梅(1967～)女，黑龙江佳木斯人，博士，教授，博士研究生导师。E-mail:dmwu@jmsu.edu.cn。

R965.2

A

1008-0104(2015)01-0015-02

2014-10-04)