呼伦贝尔地区猪源大肠杆菌血清型鉴定与耐药基因检测

邱军，张子威，樊瑞锋，王冠菊，徐世文*

呼伦贝尔地区猪源大肠杆菌血清型鉴定与耐药基因检测

邱军1,2，张子威1，樊瑞锋1，王冠菊2，徐世文1*

（1.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨150030；2.内蒙古扎兰屯农牧学校，内蒙古扎兰屯162650）

为了解呼伦贝尔地区猪大肠杆菌血清型与耐药基因情况，研究于2013～2014年从8个规模化猪场分离、鉴定出108株致病性大肠杆菌。对分离菌株进行血清型鉴定，确定以O8、O9、O149、O157为主，分属8个血清型的97株大肠杆菌菌株。研究采用PCR方法检测四环素类耐药基因（tetA、tetB、tetC、tetD）、大环内酯类耐药基因（ermB、ermC、ermF）、以及β-内酰胺类耐药基因（blaSHV-1、blaCTX-M、blaTEM）共10种耐药基因。结果显示，108株分离菌株中检测出5种耐药基因（tetA、tetB、ermB、blaCTX-M、blaTEM），与GenBank中相应基因有很高的同源性。

猪；大肠杆菌；血清型；耐药基因

临床中常见的仔猪黄痢、白痢和猪水肿病均是由猪大肠杆菌引起，由于该病发病率与死亡率较高[1]，给养猪业造成经济损失。大肠杆菌血清型较多，预防此病的疫苗间交叉免疫保护力较低，给临床有效防控带来难度。当猪群感染大肠杆菌病时，治疗以抗菌药物为主，由于抗菌药物的不规范使用和滥用，使猪大肠杆菌对抗菌药物产生耐药性，甚至多重耐药性[2]。细菌耐药性严重威胁人类与动物健康[3]。本研究对呼伦贝尔地区猪源样品进行大肠杆菌血清型鉴定以及耐药基因检测和分析，以期为该地区猪大肠杆菌病有效防控提供科学依据与理论参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2013～2014年从呼伦贝尔地区8个规模化猪场，用无菌棉拭子采集腹泻仔猪直肠内容物或腹泻死亡仔猪剖检小肠内容物样本136份，病料样本分别单独装于灭菌的10 mL EP管中，放入带冰保温箱中带回，24 h内进行细菌分离培养。

1.2 试剂与仪器

营养肉汤、普通琼脂培养基、麦康凯琼脂（MacConkey agar）、伊红美蓝琼脂（EMB agar）购于北京奥博星生物技术有限责任公司；革兰氏染液购于南京建成生物技术有限公司；肠杆菌科细菌生化编码鉴定管购于杭州天和微生物试剂有限公司；大肠杆菌标准抗“O”抗原单因子血清购于中国兽医药品监察所；质控菌E.coli ATCC25922购于中国兽医药品监察所；细菌基因组DNA提取试剂盒购于上海生工公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购于爱思进生物技术（杭州）有限公司；质粒小量抽提试剂盒（FastPlasmid Mini kit）购于康为世纪生物科技有限公司。EasyTaq PCR SuperMiX、Trans2K®DNA Marker购于北京全世金生物技术有限公司；DL500 DNA Marker购于大连TaKaRa公司。

1.3 试验动物

体质量18～22 g小白鼠，雌雄各半，由哈尔滨兽医研究所提供。

1.4 细菌分离鉴定

①细菌分离。将采样的棉拭子与小肠内容物样本加入营养肉汤培养基，37℃培养12 h，取少量菌液接种于麦康凯琼脂平板上，正置30 min后，倒置于37℃恒温培养箱中培养24 h。待麦康凯琼脂平板上形成分布均匀的粉红色菌落后，挑取典型菌落进行纯培养和鉴定。②革兰氏染色、镜检。挑取经纯化后的待检单个典型圆润粉红色菌落接种于MH肉汤中，37℃培养12 h，取一接种环菌液进行固定、革兰氏染色与镜检。③培养特性观察。待检菌纯化后分别接种于麦康凯、伊红美蓝琼脂培养基上，37℃培养12 h，观察菌落形态以及培养基颜色变化。④生化试验。将纯化好的细菌参照文献[4]方法进行MR、吲哚、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、阿拉伯糖、VP、尿素酶、硫化氢、氧化酶、硝酸盐、柠檬酸盐等生化试验，置于37℃恒温培养箱中培养24 h，观察结果。

1.5 致病性试验

已鉴定的大肠杆菌分别接种于营养肉汤培养基，37℃振荡培养12 h，然后将培养液以4 000 r·min-1离心20 min，将离心细菌沉淀物用等量灭菌生理盐水配制悬浮液作攻毒用。将分离菌株悬浮液分别给每只小白鼠腹腔注射0.2 mL，注射后6 h观察1次。对死亡小白鼠进行剖检，取肝脏，抹片，进行革兰氏染色、镜检。另设健康小白鼠10只，注射相同剂量生理盐水作对照组。

1.6 血清型鉴定

按大肠杆菌属诊断血清使用说明书要求，取分离好菌落接种麦康凯琼脂，37℃培养24 h，制作浓缩菌液，破坏其K抗原（121℃高压灭菌2 h）。在洁净载玻片上将制成的抗原与大肠杆菌标准抗“O”抗原单因子血清混匀，轻轻摇动载玻片。判定标准如下：2 min内呈现明显凝集现象的为阳性，呈均匀混浊的为阴性。出现阳性结果时以生理盐水作对照试验。

1.7 耐药基因检测

1.7.1 质粒DNA提取

按说明书采用细菌基因组快速提取细菌DNA试剂盒，质粒小量抽提试剂盒（Fast Plasmid Mini kit）提取质粒DNA。

1.7.2 目的基因PCR扩增

本研究参照文献[5-9]报道序列设计10对耐药基因特异性PCR引物，有四环素类耐药基因（tetA、tetB、tetC、tetD），大环内酯类耐药基因（ermB、ermC、ermF）、以及β-内酰胺类耐药基因（bla SHV-1、blaCTX-M、blaTEM），引物由上海生工公司合成（见表1）。PCR体系选取25 μL反应体系：即模板cDNA 2.0 μL，上下游引物各1 μL（10 pmol·μL-1），混合Tag酶9.5 μL，加入灭菌双蒸水至25 μL。PCR反应条件为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，按各引物Tm值退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环，72℃延伸10 min。取PCR反应产物5 μL，于3.0%琼脂糖凝胶中电泳，成像拍照以检测扩增效果。1.7.3基因克隆、鉴定及序列测定

表1 引物序列及目的片段长度Table 1Primer sequences and the length of destination fragment

将获得的PCR产物，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化后，连接到pMD-18T载体上，10 μL连接体系：PCR产物4.5 μL，pMD-18T载体0.5 μL，Ligation Mix 5 μL，于16℃连接2 h。连接产物转化到感受态细胞TG1，经过Amp+筛选，挑取单个菌落于5 mL含Amp+液体LB培养基中，37℃振摇过夜。采用质粒小量抽提试剂盒（FastPlasmid Mini kit）提取质粒，经PCR鉴定正确的重组质粒送往上海生工公司进行测序鉴定。通过软件DNAStar将测序结果与已知序列进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 分离、鉴定结果

分离菌株进行革兰氏染色，镜检可见红色、两端钝圆、较短的阴性小杆菌；在麦康凯琼脂平板上进行培养，呈现圆形、湿润、周边粉红、中心深红的菌落；在伊红美蓝营养琼脂平板上进行培养，呈现黑色泛金属光泽的菌落；在普通营养琼脂上进行培养，呈现圆形微凸，表面光滑湿润，浅灰色半透明菌落。分离菌株生化反应结果见表2，结合《伯杰细菌鉴定手册》[4]鉴定为大肠杆菌。本研究共从136份样本分离到108株大肠杆菌，结果见表3。

2.2 致病性试验结果

分离出的108株大肠杆菌分别给108只试验组小白鼠接种12 h后全部发病，发病小白鼠出现精神抑郁、呼吸加快、排稀便、肛门周围被毛污秽不洁；24～48 h试验小白鼠全部死亡，取死亡小白鼠肝脏进行革兰氏染色，镜检可见红色、两端钝圆、较短的阴性小杆菌，与分离菌株镜检结果相同。对照组小白鼠未见死亡。2.3血清型分布

表2 细菌生化鉴定结果Table 2Results of bacterial biochemical identification

表3 大肠杆菌分离结果Table 3Results of Escherichia coli separation

108株分离大肠杆菌经血清学试验，除11株未鉴定出血清型外，其余97株鉴定为8种不同的血清型，结果见表4，分别为O8、O9、O60、O64、O115、O139、O149、O157，其中以O8（19/108）、O9（13/108）、O149（13/108）、O157（40/108）为优势血清型。

表4 大肠杆菌血清型鉴定结果Table 4Results of Escherichia coli serotype identification

2.4 大肠杆菌耐药基因PCR检测结果

2.4.1 测序结果

经上海生工公司测序，各扩增片断序列采用DNAStar软件与GenBank上发表的相应基因序列进行比对分析后确定基因：tetA与登陆号X61367（tetA）同源性为99.2%；tetB与登陆号J01830（tetB）同源性为99.0%；ermB与登陆号KJ710358（ermB）同源性为99.1%；blaCTX-M与登陆号X92506（blaCTX-M）同源性为99.2%；blaTEM与登陆号FJ668751（bla⁃TEM）同源性为99.1%。说明扩增到的片段为相应的基因序列。

2.4.2 检测结果

经3%琼脂糖凝胶电泳分析各自PCR产物，部分PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图1～5。分离菌株四环素耐药基因只检出tetA（见图1）与tetB（见图2），检出率分别为92.60%和64.81%，未检测出tetC与tetD基因；大环内酯类耐药基因只检出ermB（见图3），检出率为4.63%，未检测出ermC与ermF基因；β-内酰胺类耐药基因只检出blaCTX-M（见图4）与blaTEM（见图5）基因，检出率分别为43.52%和88.89%，未检测出blaSHV-1基因。耐药基因阳性菌株数及检出率结果见表5。

图1 tetA基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳Fig.1Agarose gel electrophoresis of tetA gene products obtained by PCR

图2 tetB基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳Fig.2Agarose gel electrophoresis of tetB gene products obtained by PCR

图4 blaCTX-M基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳Fig.4Agarose gel electrophoresis of blaCTX-M gene products obtained by PCR

图3 ermB基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳Fig.3Agarose gel electrophoresis of ermB gene products obtained by PCR

图5 blaTEM基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳Fig.5Agarose gel electrophoresis of blaTEM gene products obtained by PCR

表5 耐药基因阳性菌株数及检出率Table 5Detected rate and number of positive strains with resistance genes

3 讨论

3.1 各地区猪大肠杆菌血清型

大肠杆菌血清型众多，且具有较强地域性分布。国外报道致病性大肠杆菌“O”型血清型主要有O8、O9、O20、O45、O64、O101、O138、O139、O141、O157、O162等[10-11]。而我国流行的致病性大肠杆菌血

清型与国外报道有较大差异，如湖北省分离株以O107、O101、O93、O9、O139、O141和O157为主[12]，华东地区分离株以O107、O101、O20、O93、O11和O149为主[13]，陕西分离株以O139、O101、O149、O141、O60为主[14]，重庆市分离株以O101、O8、O20、O64、O45、O149为主[15]，云南分离株以O24、O119、O88、O8、O9、O85为主[16]，广西分离株以O138、O18、O85、O9和O21为主[17]，河

南地区分离株以O8、O9、O161、O107为主[18]。本研究中108株分离菌株中有97株菌血清型以O8、O9、O149、O157为主，与国内外猪致病性大肠杆菌优势血清型有一定差别；同时，108株分离菌株中有11株菌未能确定血清型，是否属于新流行血清型尚待进一步研究。本研究显示，不同猪场存在多种猪大肠杆菌“O”型血清型，不同地区猪场血清型差异更大，猪场血清型复杂性可能与菌株变异有关[19]。因此，必须定期进行血清型监测，研制出当地流行优势菌株制备疫苗，进行免疫接种，才能取得较好预防效果。

3.2 猪大肠杆菌耐药基因检测情况

本研究对猪大肠杆菌四环素类、大环内酯类、β-内酰胺类三大类抗生素10种耐药基因进行扩增及检测，结果扩增到五种耐药基因。其中，四环素类耐药基因tetA、tetB检出率分别为92.60%、64.81%，tetA、tetB作为猪大肠杆菌中最普遍存在的耐药基因，与国外研究结果相同[20]。四环素类药物耐药基因存在，与四环素类药物长期广泛应用于治疗、预防以及用作生长促进剂有关[21]。细菌对四环素类药物耐药机制有外排泵、核糖体保护、酶灭活和靶位修饰4种[22]，现已发现至少有45种不同的四环素耐药基因[23]，其中tetA、tetB基因与外排泵机制相关[24]。分离菌株大环内酯类耐药基因ermB检出率为4.63%，检出率较少，可能和大肠杆菌对大环内酯类药物耐药以酶灭活机制为主，而ermB基因以靶位修饰耐药机制为主有关[25]，可能与大环内酯类药物在养猪生产中应用较少有关。β-内酰胺类耐药基因blaCTX-M、blaTEM检出率分别为43.52%、88.89%，与相关报道的动物源大肠杆菌携带的β-内酰胺类耐药基因以blaCTX-M、blaTEM为主相一致[26]。β-内酰胺类药物在临床中较常用，占抗菌药物总量的30%～40%[27]，β-内酰胺类耐药基因blaCTX-M与blaTEM存在可能与临床不规范的大量使用和滥用此类药物有关[28]。大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制是产β-内酰胺酶，其中β-内酰胺类耐药基因blaCTX-M、blaTEM均属于超广谱基因型，且主要通过质粒在细菌中传播[29]。未能扩增出和检测到tetC、tetD、ermC、ermF、blaSHV-1耐药基因，表明这些基因在呼伦贝尔地区动物源性细菌中不存在或极少。细菌耐药现象严重，目前针对大肠杆菌耐药性消除主要措施有：①针对耐药机制合理选择抗菌药物；②使用各种理化因素或中草药等消除耐药性质粒；③开发新的抗菌药与耐药抑制剂[30]。本研究显示大部分分离菌株含有多种耐药基因，耐药基因检测结果表明，该地区猪源大肠杆菌耐药性严重，应定期对猪场进行药敏试验，根据药敏试验结果选择适合药物。

4 结论

本研究阐明呼伦贝尔地区猪致病性大肠杆菌优势血清型以O8、O9、O149、O157为主，为该病有效预防和疫苗研制奠定基础；从分离菌株检测出5种耐药基因（tetA、tetB、ermB、blaCTX-M、blaTEM），为猪源大肠杆菌耐药性产生分子机理方面研究提供参考。

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Serotype identification and resistance gene detection of swineEsche⁃richia coliin Hulunbeir/

QIU Jun1,2,ZHANG Ziwei1,FAN Ruifeng1,WANG Guanju2,XU Shiwen1(1.School of Veterinary Medicines,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Inner Mongolia ZhalantunAgricultural and Grazing School,Zhalantun Inner Mongolia 162650,China)

In order to study conditions of the swineEscherichia coliserotypes and drug resistance genes in the Hulunbeir.Total 108 strains pathogenicEscherichia colifrom eight farms were isolated and identified in 2013-2014.And 97 strains ofEscherichia colimainly belonged to O8,O9,O149and O157,and all belonged to eight serotypes.In this study,PCR method was used to detect the tetracycline resistance genes (tetA,tetB,tetC,tetD),macrolide resistance genes(ermB,ermC,ermF),and beta lactam resistance genes (blaSHV-1,blaCTX-M,blaTEM).The results showed that five kinds of drug resistance genes(tetA,tetB, ermB,blaCTX-M,blaTEM)had a very high homology with the corresponding genes in GenBank from the 108 strains of swineEscherichia coli.

pig;Escherichia coli;serotype;resistance gene

S858.28

A

1005-9369（2015）07-0050-07

时间2015-7-9 14:42:57[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150709.1442.015.html

邱军,张子威,樊瑞锋,等.呼伦贝尔地区猪源大肠杆菌血清型鉴定与耐药基因检测[J].东北农业大学学报,2015,46(7)∶50-56.

Qiu Jun,Zhang Ziwei,Fan Ruifeng,et al.Serotype identification and resistance gene detection of swineEscherichia coliin Hulunbeir[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(7)∶50-56.(in Chinese with English abstract)

2015-01-23

环保部公益性项目（200909043）

邱军（1975-），男，讲师，博士，研究方向为环境毒理。E-mail:979191050@qq.com

*通讯作者：徐世文，教授，博士生导师，研究方向为环境毒理。E-mail:1009598967@qq.com