费氏丙酸菌的固定化方法及其发酵丙酸的工艺条件研究

马志刚，王亚军，王德培

（天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

费氏丙酸菌的固定化方法及其发酵丙酸的工艺条件研究

马志刚，王亚军，王德培

（天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

为提高丙酸发酵效率，进行了固定化费氏丙酸菌发酵丙酸的研究.采取吸附-包埋结合法，先以麸皮进行吸附，再用海藻酸钠-聚乙烯醇进行包埋制备固定化细胞.通过正交实验确定了固定化细胞的工艺条件：菌液与麸皮比例为5，mL∶0.6，g，吸附时间为15，min，包埋剂选用海藻酸钠和聚乙烯醇混合物，质量比为3∶3，此条件下的包埋效率达到96.86%.初步研究了碳源及其质量浓度对固定化细胞生产丙酸的影响，确定了以乳酸钠为碳源，质量浓度为40，g/L，丙酸产量可达13.75，g/L.

费氏丙酸菌；固定化；载体；丙酸；工艺条件

丙酸作为一种重要的大宗化学品，广泛应用于各种工业生产中［1-3］.丙酸的生产方法有化学合成法和生物发酵法［4-7］，由于发酵法生产效率低、成本高［8］，目前，丙酸的工业化生产方法为化学合成法［9］.因此，如何提高生产效率是实现发酵法生产丙酸的技术关键.固定化丙酸菌是提高丙酸生产能力的有效方法之一［10］.

本文采用吸附-包埋结合法，根据前期实验中通过对玉米芯粉、麸皮和米糠几种吸附剂固定化细胞的稳定性、包埋效率以及发酵丙酸能力的综合考虑，选择以麸皮作为吸附剂，然后采用两种不同比例包埋剂，增强细胞固定效果，提高固定化细胞使用效率，从而提高丙酸生产能力.

1 材料与方法

1.1 菌种

费氏丙酸菌（Propionibacterium freudenreichii），本实验室保存.

1.2 培养基

活化培养基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，磷酸铵5，pH 7.2.

丙酸菌增殖培养基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，磷酸铵5，碳酸钙3，pH 7.2.

发酵培养基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，磷酸铵5，碳酸钙3，pH 7.2.

1.3 培养方法

1.3.1 费氏丙酸菌的增殖培养

将活化好的菌株接到50，mL（250，mL三角瓶）增殖培养基中，接种量为2%，30，℃、180，r/min摇床培养20，h.

1.3.2 固定化费氏丙酸菌的发酵培养

接种量为3%，装液量为250，mL，磨口三角瓶装液100，mL，发酵温度30，℃，静置培养72，h.

1.4 实验方法

1.4.1 固定化菌体的制备

（1）菌悬液的制备：取已增殖培养的丙酸菌液200，mL放入离心杯中，18，000，r/min离心10，min，去除上清液，再加入生理盐水摇匀，然后离心洗涤2次.加入60，mL无菌水摇匀制成菌悬液.

（2）包埋剂的制备：按比例称取一定量的聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（CA），加入15，mL去离子水加热溶化，搅拌至充分混合，封口，放置到灭菌锅中，115，℃灭菌20，min.

（3）交联剂的制备：称取一定量的硼酸、无水氯化钙按比例溶于水中，配成30，g/L的氯化钙溶液以及30，g/L氯化钙和30，g/L硼酸的混合溶液.

（4）固定化凝胶菌球的成型：按比例向5，mL菌悬液中加入0.6，g吸附剂（麸皮），混匀，吸附10，min，然后将配好的包埋剂倒入上述混合液中，混匀，利用注射器吸取并滴入到交联剂溶液中，形成菌球.

（5）交联：将该菌球交联24，h，用生理盐水冲洗，然后转到生理盐水中，置于4，℃冰箱保存.

1.4.2 包埋剂比例及交联剂的确定

选择海藻酸钠和聚乙烯醇作为包埋剂，CA与PVA质量比（g∶g）分别为：3∶8、3∶6、3∶4、2∶8、2∶6、2∶4，总体积20，mL.

选择30，g/L氯化钙、30，g/L硼酸的混合溶液和单独的30，g/L氯化钙溶液作为交联剂制备固定化菌球，观察球体状况.

1.4.3 正交实验确定固定化菌体制备条件

正交实验因素及水平见表1.

表1 正交实验因素水平表Tab. 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.4.4 碳源对固定化丙酸菌产丙酸的影响

分别以葡萄糖和乳酸钠为碳源进行丙酸发酵，测定丙酸含量，计算丙酸转化率.

1.5 分析方法

1.5.1 包埋效率的计算

总活菌数：采用10，µL微量菌落计数法.

菌球表面游离与洗脱菌数：将制好的菌球加入生理盐水冲洗，洗液作活菌计数.

包埋效率=（总菌数-游离与洗脱菌数之和）/总活菌数×100%

1.5.2 丙酸菌代谢产物丙酸的测定

参见文献［11］.

2 结果与讨论

2.1 包埋剂比例及交联剂的确定

不同包埋剂比例、不同交联剂固定化后的实验结果见表2.对于不同包埋剂比例，以30，g/L氯化钙为交联剂固定化后的菌球状况均优于30，g/L氯化钙和30，g/L硼酸混合溶液作为交联剂的菌球状况，因此选择30，g/L氯化钙溶液为交联剂；对于CA与PVA质量比分别为3∶4和2∶4的包埋剂，成球较好.

表2 不同包埋剂比例、不同交联剂固定化后的菌球状况Tab. 2 Immobilized test result of different ratio of entrapping agent to cross-linking agent

2.2 正交实验确定固定化菌体制备条件

正交实验结果及极差分析、方差分析分别见表3和表4.

表3 正交实验结果及极差分析Tab. 3 Analysis of orthogon al design result and range

表4 正交实验方差分析Tab. 4 Analysis of orthogonal design variance

根据正交实验结果可确定固定化细胞发酵丙酸的最佳工艺条件为：菌液与麸皮比例为5，mL∶0.6，g，包埋剂的CA与PVA质量比为3∶3，吸附时间为15，min，此时的包埋效率为96.86%.

根据方差分析结果，比较各因素对发酵丙酸产量的影响可知，影响最显著的是吸附时间，其次是包埋剂比例，影响最小的是菌液与吸附剂的比例.

2.3 碳源对固定化丙酸菌产丙酸的影响

2.3.1 葡萄糖质量浓度对丙酸菌发酵的影响

不同质量浓度葡萄糖为碳源时费氏丙酸菌的丙酸生产曲线见图1.从图1可以看出：发酵8，h，各质量浓度葡萄糖为碳源的丙酸产生速率均较快，丙酸产生速率分别为0.98、0.78、0.53、0.54，g/（L·h）；随着发酵时间的增加，较低质量浓度葡萄糖为碳源的产酸速率大于高质量浓度的葡萄糖，并逐渐趋于平缓，这是因为酸的产生抑制了丙酸菌的发酵［12］.同时可以看出：葡萄糖（底物）质量浓度越高，对丙酸菌的抑制作用越强，底物的利用率越低；以40，g/L葡萄糖为碳源，发酵56，h丙酸产量达到最大值.

图1 葡萄糖为碳源时费氏丙酸菌的丙酸生产曲线Fig. 1Propionic acid production by P. freudenreichii with glucose as the carbon source

不同质量浓度葡萄糖为底物时的丙酸转化率见表5.从图1和表5可以看出：60、80，g/L葡萄糖质量浓度的丙酸转化率低，发酵效果不理想；20、40，g/L葡萄糖为底物的丙酸产量（丙酸产量=葡萄糖质量浓度×丙酸转化率）分别为10.62、11.28，g/L.可见，虽然与20，g/L葡萄糖为底物的丙酸转化率（53.10%）相比，40，g/L的丙酸转化率相对较低（28.19%），但其丙酸产量较高，是较适合的底物浓度.

表5 葡萄糖为底物时丙酸转化率Tab. 5 Analysis of production data with glucose as the substrate

2.3.2 乳酸钠质量浓度对丙酸菌发酵的影响

不同质量浓度乳酸钠为碳源时费氏丙酸菌的丙酸生产曲线见图2.从图2可以看出：发酵8，h，以40，g/L乳酸钠为碳源时丙酸产生速率较快；发酵到32，h时，以20、40、60，g/L乳酸钠为碳源的丙酸产生速率趋于平稳，分别为0.28、0.29、0.25，g/（L·h）；随着时间的增加，以40，g/L乳酸钠为碳源的产酸速率高于其他浓度，发酵64，h丙酸产量达到最大值.

图2 乳酸钠为碳源时费氏丙酸菌的丙酸生产曲线Fig. 2 Propionic acid production by P. freudenreichiiwith sodium lactate as the carbon source

不同质量浓度乳酸钠为底物时的丙酸转化率见表6.从图2和表6可以看出：80，g/L乳酸钠为底物的丙酸产量为4.41，g/L，丙酸转化率为5.51%，丙酸产量和丙酸转化率都很低；20、40、60，g/L乳酸钠为底物的丙酸产量分别为10.49、13.75、10.04，g/L，都在10，g/L以上，但60，g/L乳酸钠为底物的丙酸转化率（16.74%）较低；另外，虽然与20，g/L乳酸钠为底物的丙酸转化率（52.44%）相比，40，g/L的丙酸转化率相对较低（34.38%），但其丙酸产量（13.75，g/L）较高，是较适合的底物浓度.

表6 乳酸钠为底物时的丙酸转化率Tab. 6 Analysis of production data with sodium lactate as the substrate

从以上葡萄糖和乳酸钠为碳源的实验结果可以看出：发酵初期的碳源消耗较大，丙酸产生速率较高；随后的发酵中，以葡萄糖为碳源的发酵曲线相对平缓，以乳酸钠为碳源的曲线呈梯度缓慢上升直至发酵中后期.出现此结果是因为，丙酸菌以葡萄糖和以乳酸钠为碳源时代谢途径不同，当以葡萄糖为单一碳源时，丙酸积累到一定浓度会对菌株生长和产酸产生反馈抑制，所以发酵8，h后丙酸浓度上升平缓.与40，g/L葡萄糖相比，40，g/L乳酸钠的丙酸产量较高，为13.75，g/L，丙酸转化率为34.38%，与Lewis 等［12］的结论一致.

3 结 论

本文通过实验确定了先以麸皮进行吸附，再用海藻酸钠-聚乙烯醇进行包埋的方法制备固定化细胞.确定了固定化细胞的工艺条件：菌液与麸皮比例为5，mL∶0.6，g，吸附时间为15，min，包埋剂的海藻酸钠与聚乙烯醇质量比为3∶3，此条件下的包埋效率为96.86%.

分别以葡萄糖、乳酸钠作为单一碳源，进行固定化丙酸菌发酵生产丙酸，相比40，g/L葡萄糖，40，g/L乳酸钠丙酸产量高，达到13.75，g/L，丙酸转化率也高，达到34.38%，是丙酸发酵较好的碳源.

［1］ 孟晖. 三丙市场需求强劲前景看好：丙醛，丙醇，丙酸生产与市场分析［J］. 中国石油和化工，2004（7）：28-30.

［2］ 菅秀君，丁文光，胡望明. 丙酸的生产工艺及应用前景［J］. 齐鲁石油化工，2004，32（1）：32-35.

［3］ 周纯海，黄科林，宁红，等. 丙酸的合成进展和应用以及市场前景［J］. 化工技术与开发，2006，35（7）：11-13.

［4］ 廖列文，崔英德. 丙酸及其酯类的合成与应用进展［J］.化工进展，2001，20（8）：38-41.

［5］ 董翠平，郝兴锋. 丙酸的生产技术及市场前景［J］. 精细石油化工进展，2003，4（2）：51-54.

［6］ 张华峰，康慧. 微生物发酵法生产丙酸［J］. 饲料工业，2004，25（8）：29-33.

［7］ 熊海燕，王为国，曾东方，等. 微生物发酵法生产丙酸的研究进展［J］. 江苏调味副食品，2005，22（5）：10-13.

［8］ Goswami V，Srivastava A. Propionic acid production in an in situ cell retention bioreactor［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2001，56（5/6）：676-680.

［9］ Goswami V，Srivastava A K. Fed-batch propionic acid production by Propionibacterium acidipropionici［J］. Biochemical Engineering Journal，2000，4（2）：121-128.

［10］ 赵树欣，梁慧珍，程丽娟，等. 固定化丙酸菌发酵底物的研究［J］. 中国食品添加剂，2005（1）：7-11.

［11］ 揣玉多，王德培，王艳萍，等. 丙酸高产菌株的复合诱变选育［J］. 食品与发酵工业，2007，33（6）：45-49.

［12］ Lewis V P，Yang S T. Propionic acid fermentation by Propionibacterium acidipropionici：Effect of growth substrate［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，1992，37（4）：437-442.

责任编辑：常涛

Immobilization of Propionibacterium freudenreichii and the Processing Condition of its Propionic Acid Fermentation

MA Zhigang，WANG Yajun，WANG Depei
（College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

In order to improve the efficiency of propionic acid fermentation，propionicacid fermentation with immobilized Propionibacterium freudenreichii were investigated. Adsorption-entrapping method was used to prepare immobilized cells with bran as the adsorbent and CA-PVA as the entrapping material. Through orthogonal experiment，the propionic acid immobilized cells' fermentation process conditions were determined. The proportion of bacterium solution to bran was 5，mL∶0.6 g，the adsorption time was 15，min，the entrapping agent was the mixture of CA and PVA，the mass ratio was 3∶3. Under this immobilization conditions，the encapsulation efficiency reached 96.86%. The effect of the carbon sources and their concentration on propionic acid production were investigated. The experimental results showed that the sodium lactate was a better carbon source.When the sodium lactate concentration was 40，g/L，the yield of propionic acid reached 13.75，g/L.

Propionibacterium freudenreichii；immobilization；carrier；propionic acid；process condition

Q93 文献标志码：A 文章编号：1672-6510（2015）01-0025-04

10.13364/j.issn.1672-6510.20130176

2013-12-26；

2014-08-11

马志刚（1981—），男，河北人，硕士研究生；通信作者：王德培，教授，wangdp@tust.edu.cn.