5-羟色胺及其受体亚型在慢性前列腺炎大鼠脊髓的差异性表达

张述蓉，赵秀娟，李 露，徐 晨,2*

(重庆医科大学 1.生命科学研究院； 2.电子显微镜室， 重庆 400016)



5-羟色胺及其受体亚型在慢性前列腺炎大鼠脊髓的差异性表达

张述蓉1，赵秀娟1，李 露1，徐 晨1,2*

(重庆医科大学 1.生命科学研究院； 2.电子显微镜室， 重庆 400016)

目的研究5-HT和5-HT2A、5-HT2C、5-HT5A和5-HTR7受体(5-HTR2A、5-HTR2C、5-HTR5A和5-HTR7)在慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征(CP/CPPS)大鼠T13～S1脊髓节段的差异性表达。方法将SD大鼠随机分为对照组、45 d、60 d和90 d模型组，用自身免疫法构建CP/CPPS模型。用免疫组织化学及RT-PCR法检测脊髓T13～L2、L3～L4和L5～S1节段5-HT及各受体的表达。结果CP/CPPS大鼠自发性疼痛行为学评分显著高于对照组(P<0.05)。5-HT在各模型组大鼠脊髓3个节段表达均下降。在T13～L2节段, 5-HTR2A、5-HTR5A的表达持续上调(P<0.05)，5-HT2C、5-HTR7先升高后下降(P<0.05)；在L3～L4节段各受体表达均先升高后下降(P<0.05)；在L5～S1节段，5-HT2C、5-HTR5A的表达持续上调(P<0.05)，5-HTR2A、5-HTR7先升高后下降(P<0.05)。结论5-HT及5-HTR2A、5-HTR2C、5-HTR5A和5-HTR7在不同时程CP/CPPS大鼠脊髓出现差异性表达，提示5-HT及其受体参与了CP/CPPS的中枢调控，其具体机制有待进一步的研究。

5-羟色胺；5-羟色胺受体；慢性前列腺炎；脊髓；大鼠

慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征(chronic prostatitis /chronic pelvic pain syndrome，CP/CPPS)是泌尿系统最常见的疾病之一，在男性中的发病率为9%～16%[1]。CP/CPPS临床表现多样，主要包括下尿路症状、疼痛，并常伴有神经精神症状等。目前CP/CPPS的发病机制尚不明确，多数学者认为可能是感染、免疫失调、神经性疼痛和盆底肌肉痉挛等多种致病机制共同作用的结果[2]。5-HT(serotonin)作为神经递质和血管活性物质，广泛分布在周围组织和中枢神经系统中。近年来关于中枢神经系统内5-HT对排尿反射、抑郁和疼痛的调节方面的研究取得了相当大的进展，认为5-HT可能参与了上述过程的调控[3]。研究表明5-HT2A、5-HT5A和5-HT7受体在大鼠脊髓支配盆底肌群的Onuf’s核有特异性表达[4- 5]。有关5-HT受体在CP/CPPS的差异性表达情况未见研究报道，本研究旨在研究5-HT及5-HTR2A、5-HTR2C、5-HTR5A和5-HTR7在CP/CPPS大鼠脊髓的差异性表达，为进一步探讨其在CP/CPPS发病机制中的作用提供基础研究数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

SPF级雄性SD大鼠[重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(渝)20070001]。百白破疫苗(武汉生物制品研究所，批号：20080620- 5)。完全弗氏佐剂(Sigma公司)。兔抗鼠5-HT抗体(Immunostar公司)。生物素化羊抗兔IgG、ABC复合物、 DAB显色剂(北京中杉金桥公司)。RNA提取试剂、反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒(TakaRa公司)。其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 模型制备

大鼠CP/CPPS造模方法按参考文献[6]操作。

1.3 自发性疼痛行为学检测

自发疼痛行为观察指标及评分参照参考文献[7]。

1.4 免疫组织化学

取灌流固定的脊髓各节段，振动切片机切片，片厚50 μm。1∶2 000稀释的5-HT抗体于4 ℃孵育24 h后，37 ℃孵育1∶500稀释的生物素化羊抗兔IgG 120 min；最后37 ℃孵育ABC复合物90 min，DAB显色剂显色。用Olympus CX31RBSF采集图像，北航医学图像分析系统测量平均吸光度值。

1.5 RT-PCR

用RNA提取试剂盒提取总RNA，对OD260/D280值在1.8～2.1之间者反转录为cDNA，取cDNA,用PTC- 100 PCR仪进行热循环。以上所有操作均按试剂盒说明书进行。取扩增产物10 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描成像系统对条带吸光度进行分析，用Labworks软件计算相对表达量。

5-HT受体各亚型及GAPDH引物序列均由上海生工生物技术公司设计并合成，引物序列见表1。

1.6 统计学分析

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 结果

2.1 自发性疼痛行为学评分

各模型组大鼠疼痛行为评分均较对照组显著升高(P<0.05)(表2)。

2.2 5-HT在各脊髓节段的表达

T13～L2节段脊髓背角的5-HT平均吸光度值随造模时程逐渐降低，60 d组和90 d组脊髓背角的5-HT平均吸光度值较对照组显著降低(P<0.05)。L3～L4节段在45 d及90 d 组脊髓背角5-HT平均吸光度值较对照组显著降低(P<0.05)。L5～S1节节段在90 d组大鼠脊髓背角5-HT平均吸光度值较对照组显著降低(P<0.05) (图1，表3)。

表2 自发性疼痛行为学评分

*P<0.05 compared with control group.

图1 脊髓5-HT免疫组化结果Fig 1 The expression of 5-HT in spinal by immunohistochemisty(×100)

表3 各脊髓节段后角5-HT平均吸光度值

*P<0.05 compared with control group.

2.3 各受体亚型在脊髓节段的表达

各组大鼠脊髓3个脊髓节段均检测5-HT受体亚型mRNA 的表达 (图2)。各模型组5-HTR2A在T13～L2、L3～L4节段的表达量均显著高于对照组(P<0.05)，呈先升高后下降，但在L5～S1节段后期出现显著的下调(P<0.05)； 5-HTR2C在各模型组T13～L2、L5～S1节段的表达量均显著高于对照组(P<0.05)，在L5～S1节段持续升高，而在L3～L4节段呈先升高后降低；5-HTR5A在T13～L2、L5～S1节段表达量持续上调，且各模型组显著高于对照组(P<0.05)，在L3～L4节段45 d组急剧升高后回落至接近正常水平；各模型组5-HTR7在3个脊髓节段的表达均显著高于对照组(P<0.05)，呈先升高后下降 (图3)。

图2 RT-PCR法检测各脊髓节段5-HT受体亚型表达的电泳结果

*P<0.05 compared with control group图3 5-HT受体亚型mRNA在3个脊髓节段各组的相对表达量

3 讨论

疼痛是CP/CPPS的主要症状。有学者认为慢性前列腺炎疼痛是在前列腺受到刺激后通过脊髓反射引起的一种盆底、会阴肌肉的反射性痉挛性疼痛，研究发现5-HTR2A、5-HTR5A和5-HTR7除广泛分布于脊髓背角以外，还分布于大鼠脊髓Onuf’s核内不同的运动神经元，其中5-HTR2A主要分布于支配盆底坐骨海绵体肌的运动神经元，而5-HTR5A和5-HTR7受体主要分布于支配尿道外括约肌的运动神经元[4- 5]。本研究采用自身免疫法构建CP/CPPS大鼠模型，选取支配前列腺的相应脊髓节段T13～L2、L3～L4和L5～S1[8- 9]研究5-HT及5-HTR2A、5-HTR2C、5-HTR5A和5-HTR7的表达情况。

研究结果表明，无论是对照组还是模型组各5-HT受体亚型在不同脊髓节段的表达均存在差异，这提示5-HT在不同脊髓节段可能参与不同生理功能调节。不同时程模型组大鼠自发性疼痛行为学评分均显著高于对照组，同时5-HT各受体亚型在CP/CPPS大鼠3个脊髓节段的表达几乎都升高，提示5-HTR2A、5-HTR2C、5-HTR5A、5-HTR7在脊髓Onuf’s核的高表达可能通过影响盆底肌群参与了CP/CPPS疼痛形成，这与已报道的5-HTR2A、5-HTR5A、5-HTR7在炎性反应或神经病理性疼痛模型脊髓水平表达上调的结果是一致的[10- 11]。近年来的研究表明，在脊髓水平5-HT2C、5-HTR5A和5-HTR7主要参与疼痛抑制作用，而5-HTR2A主要参与疼痛的易化作用[11- 12]，但鞘内注射5-HT受体激动剂α-甲基- 5羟色胺和DOI可以剂量依赖性地抑制SNL神经病理性疼痛模型的机械痛和热痛觉过敏[13]，这提示5-HTR2A可能参与镇痛。在本实验中，5-HTR2A在L3～L4、L5～S1节段的表达分别在45 d、60 d达到高峰后出现下调，变化趋势与疼痛评分变化一致，因此认为5-HTR2A在脊髓水平主要参与致痛。5-HTR2C、5-HTR5A的表达在90 d模型组自发性疼痛行为减少的情况下继续上调，这提示在CP/CPPS后期由于参与镇痛效应的5-HTR2C、5-HTR5A持续上调，使5-HT在脊髓水平主要发挥镇痛作用，使自发性疼痛行为评分下降。5-HTR7在模型组动物45 d开始升高，在造模60 d达到高峰，而在90 d时其表达量有所回落但仍显著高于对照组，这提示5-HTR7可能在疼痛的产生和维持中发挥着重要的作用。对5-HT的研究发现，所有模型组大鼠各脊髓节段5-HT表达较对照组均下降，这与来自神经病理性疼痛研究中脊髓5-HT表达增高[14]的结果并不一致，造成这种差异的原因可能有：本研究采用CP/CPPS模型，主要表现为慢性疼痛，区别于一般疼痛研究所采用的急性疼痛模型；同时该模型还存在抑郁表现[15]及排尿功能障碍[6]，而已知5-HT同时参与上述这些过程，因此在CP/CPPS模型中5-HT的变化更加复杂。另一方面，5-HT受体表达升高也可负反馈调节引起5-HT递质释放减少。

综上所述，在大鼠CP/CPPS模型的不同时期5-HT及5-HTR1A、5-HTR2A、5-HTR2C、5-HTR5A、5-HTR7在脊髓T13-S1各节段出现差异性表达，提示5-HT及其受体参与了CP/CPPS疼痛症状的中枢形成机制，值得进一步深入研究。

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科普沙龙

人诱导多功能干细胞可在脊髓损伤后呈长距离轴突生长

从一个健康的86岁男性体内取得的多潜能干细胞(iPSCs)可分化成神经干细胞，将其移植到脊髓损伤后有免疫缺陷的成年小鼠身上，在C5半侧切3个月后，人诱导多潜能干细胞(iPSCs)不但存活还分化成神经元，其神经胶质细胞不但从病变部位伸长出成千上万的轴突，并且几乎与大鼠中枢神经系统一样长。这些诱导多潜能干细胞衍生的轴突从损伤脊髓白质生长出来，经常穿越灰质，并且和大鼠神经元形成突触。接着，宿主的脊髓运动神经元轴突也穿入诱导多潜能干细胞移植物并分化形成轴突。这些结果表明，内在的神经机制容易克服成体脊髓损伤后的抑制性微环境(inhibitory milieu)的影响，从而生长出许多轴突并延伸很长的距离。

择句翻译：

These capabilities persist even in neurons reprogrammed from very aged human cells.

即使取自很年长人的重编程神经元，它们也仍保持着这些能力。

陈至鑫 编译自Translational Medicine 2014/6/26

章静波 审校

Differential expression of serotonin and its receptor subtypes in spinal cord of chronic prostatitis model in rat

ZHANG Shu-rong1, ZHAO Xiu-juan1, LI Lu1, XU Chen1,2*

(1.Institute of Life Sciences; 2.Electron Microscope Room，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China)

ObjectiveTo study the different expressions of serotonin(5-HT) and serotonin receptor subtypes(5-HTRs) in T13～S1 spinal segments of chronic prostatitis rat models.MethodsSprague Dawley rats were randomly divided into control group，45 d，60 d and 90 d model groups. Chronic prostatitis /chronic pelvic pain syndrome of rats were induced by autoimmune. The level of 5-HT was detected by immunohistochemistry and the expression of 5-HTRsgene were detected by RT-PCR in T13～L2，L3～L4，L5～S1 spinal segments in chronic prostatitis rats.ResultsThe spontaneous pain behavior score of CP/CPPS rats was significantly higher as compared with control group (P<0.05). The levels of 5-HT in three spinal segments in all CP/CPPS model groups were decreased, 45 d and 90 d model group decreased significantly (P<0.05). The expression of 5-HTR2A，5-HTR5Ashowed a gradually increasing and 5-HT2C，5-HTR7 were increased at the first and then decreased in T13～L2 spinal segments(P<0.05). The expressions of all receptors were decline after rising first in L3～L4 spinal segments (P<0.05). The expression of 5-HT2C，5-HTR5Ashowed a gradually increasing and 5-HTR2A，5-HTR7 were decline after rising

serotonin；serotonin receptors；chronic prostatitis；spinal cord； rat

2014- 12- 25

：2015- 03- 13

重庆市自然科学基金(CSTC，2009BA5081)

*通信作者(correspondingauthor)：xuchen@cqmu.edu.cn

1001-6325(2015)05-0668-06

研究论文

R697+.33

：A

first in L5～S1 spinal segments (P<0.05).ConclusionsThere is a distinct expression pattern of 5-HT and 5-HTRsat different stages of CP/CPPS rat, suggesting that 5-HT amd its receptors may involve in the central regulation mechanism of CP/CPPS，further studies are needed for the specific mechanism.