乳腺癌组织IL-17A与VEGF表达及微血管密度临床意义研究

伦俊杰 孙建业 殷好治 余南荣 滕祖栋

乳腺癌组织IL-17A与VEGF表达及微血管密度临床意义研究

伦俊杰 孙建业 殷好治 余南荣 滕祖栋

目的 探讨白细胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）在乳腺癌发生、发展中的作用及其与VEGF、微血管密度的相关性。方法 采用免疫组化法检测70例乳腺癌组织和对应癌旁正常组织中IL-17A、VEGF蛋白和CD34标记微血管密度表达情况。结果 乳腺癌组织中IL-17A、VEGF、CD34阳性率分别为78.6%(55/70)、68.6%（48/70）和64.2%（45/70），显著高于癌旁正常乳腺组织24.3%（17/70）、30.0%(21/70)和31.4%（22/70），差异有统计学意义（P＜0.05）。有淋巴结转移的患者IL-17A阳性率显著高于无淋巴结转移患者（P=0.005），Ⅲ+Ⅳ期患者IL-17A阳性率显著高于Ⅰ+Ⅱ期患者（P=0.018）。IL-17A表达与患者年龄、肿瘤直径、组织学分级、血管神经淋巴管侵犯、PR及ER水平无关。IL-17A与VEGF、CD34在乳腺癌中的表达呈正相关（r=0.688，P=0.0032；r=0.724，P=0.0015）。乳腺癌组织中IL-17A阳性表达组MVD显著高于阴性表达组（P=0.000）。结论 乳腺癌组织中IL-17A、VEGF、CD34高表达，IL-17A高表达可能通过促进VEGF，进而促进血管生成促进肿瘤进展，IL-17A可望成为乳腺癌抗血管治疗的新靶点。

乳腺肿瘤；白细胞介素-17A；VEGF；微血管密度

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势。辅助性T细胞-17（Helper T cells 17，Th17）细胞是近年来发现的一类与Th1、Th2及Treg细胞不同的新型效应CD4+T细胞，白细胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）是Th17细胞分泌的主要细胞因子之一[1]，IL-17A促进肿瘤血管生成，IL-17A促进了乳腺癌的发生发展[2-3]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在乳腺癌细胞中的表达和促血管新生的活性已经被证实[4]。本文通过检测IL-17A、VEGF、CD34在乳腺癌组织中的表达，分析三者的关系及在乳腺癌发生、发展中的意义。

1 资料与方法

1.1 标本来源 收集昌乐县人民医院2011年1月～2013年6月行手术切除的乳腺癌病理腊块70份。患者均为女性。年龄31～72岁，中位年龄51岁。均经病理学确诊，术前均未行其它治疗。乳腺浸润性导管癌55例，浸润性微乳头状癌8例，浸润性小叶癌7例。组织学分级：高分化28例，中分化34例，低分化8例。按照美国癌症联合委员会2010年乳腺癌TNM分期标准：Ⅰ期10例，Ⅱ期34例，Ⅲ期24例，Ⅳ期2例。另以距肿瘤组织＞3cm的癌旁乳腺组织70例作对照，经病理学确诊为正常乳腺组织。均为女性，年龄31～70岁，中位年龄50岁。

1.2 主要试剂 鼠抗人IL-17A单克隆抗体购自美国Abcam公司，兔抗人血管内皮生长因子、CD34单克隆抗体、PV-6000及DAB免疫组化试剂盒均购自北京中杉金桥公司。

1.4 免疫组化染色 采用免疫组化二步法检测标本，操作按PV-6000试剂盒说明书进行，石蜡标本5μm厚连续切片，组织切片常规脱蜡、水化，3%H2O2去离子水孵育15min以阻断内源性过氧化物酶，PBS缓冲液冲洗，分别滴加鼠抗人IL-17A单克隆抗体、兔抗人血管内皮生长因子、CD34单克隆抗体，室温过夜，PBS缓冲液冲洗，2min×3次，滴加抗体，室温孵育20min，PBS缓冲液冲洗，2min×3次，经DAB显色、复染、脱水，中性树胶封片后编号，PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.5 结果判定标准 免疫组化的阳性细胞计数采用双盲法，两位病理医师独立观察每张病理切片后作出判断，并一起得出结论。选择10个高倍镜(×400)视野，每个视野计数20个细胞，根据细胞染色百分比进行评分。每张切片IL-17A、VEGF免疫组化染色总分为细胞染色强度+染色细胞阳性率。细胞染色强度：细胞无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。细胞染色阳性率：阴性为0分，＜25%为1分，26%～50%为2分，50%～75%为3分，76%～100%为4分。最后得分0～2阴性，大于3分为阳性表达。采用免疫组化法检测CD34标记的肿瘤血管，计数MVD值。微血管密度计数，首先在100倍镜下选择CD34染色较为集中的部位，然后调节到400倍显微镜视野下进行微血管计数。计数原则为：任何被CD34抗体染成棕黄色的孤立的内皮细胞可作为一个计数单位；单个内皮细胞簇团，作为1个计数单位。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。各组间阳性率的比较采用χ2检验，组间比较用Student’s t检验，相关性分析采用Spearman等级相关检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 IL-17A、VEGF和CD34的表达 乳腺癌组织中可见IL-17A高表达。IL-17A在乳腺癌组织中阳性率为78.6%(55/70)，显著高于癌旁正常乳腺组织24.3%（17/70），差异有统计学意义（χ2=41.3，P=0.000）。VEGF在乳腺癌组织中阳性表达为68.6%（48/70），正常乳腺组织为30.0%（21/70），差异有统计学意义（χ2=20.1，P=0.00）。CD34乳腺癌组织中阳性表达率为64.2%（45/70），正常乳腺组织中有22例（31.4%）为阳性，差异有统计学意义（χ2=15.1，P=0.000）。

2.2 IL-17A与病理特征的关系 IL-17A在有淋巴结转移患者中阳性率88.9%(40/45)，无淋巴结转移患者IL-17A阳性率60%(15/25)，差异有统计学意义（P=0.005），Ⅰ+Ⅱ期患者IL-17A阳性率68.18%(30/44)，Ⅲ+Ⅳ患者IL-17A阳性率96.15%(25/26)，差异有统计学意义（P=0.014）。IL-17A的表达与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤组织学分级，是否血管神经淋巴管侵犯，ER、PR表达情况无关。见表1。

表1 IL-17A在乳腺癌组织中的表达及临床因素关系（n）

2.3 IL-17A的表达与VEGF及MVD的关系 70例乳腺癌组织中IL-17A、VEGF及MVD表达水平差异无统计学意义（χ2=3.61，P=0.16）。70例乳腺癌组织同时表达IL-17A、VEGF及MVD共42例（60.0%）。Spearman等级相关分析显示，乳腺癌组织中IL-17A的表达与VEGF表达呈正相关（r=0.688，P=0.0032）；IL-17A与CD34的表达呈正相关（r=0.724，P=0.0015）。IL-17A阳性表达组MVD值为(81.7±10.9)，显著高于IL-17A阴性表达组(48.1±9.2)（P=0.000）。

3 讨论

辅助性T细胞17（Helper T cells 17，Th17）是以高分泌白介素（interleukin,IL）17为特征的CD4+T细胞，其家族成员包括IL-17A、IL-17B、IL-C、IL-17D、IL-17E、IL-17F六个亚型[1]，IL-17A作为Th17细胞分泌的主要细胞因子，在肿瘤的生长与分化方面起了重要的作用，在结肠癌小鼠模型中，IL-17A基因缺失的小鼠肿瘤数目（1.43 vs 5.80，P=0.02）及肿瘤大小（1.17 vs 3.58mm，P=0.01）均减少，肿瘤细胞增殖指数降低[5]。IL-17在肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、多发骨髓瘤等多种恶性肿瘤中表达增强[6-10]，促进了肿瘤进展。Lihong Wang等的研究表明，中国汉族女性IL-17A单核苷酸基因多态性与乳腺癌发病相关[3]。Yang L等[11]研究表明在乳腺癌组织中TH17细胞的表达水平较正常组织有统计学意义，血液中Th17细胞水平与TNM分期，微血管密度，淋巴结转移成正相关，另有研究发现[12]，进展期乳腺癌组织中，IL-17A的表达增加进展期乳腺癌的侵袭性，IL-17A表达与患者的愈后成负相关。通过免疫组化方法研究乳腺癌组织微环境中TH17细胞浸润情况与临床病理关系发现，TH17细胞与肿瘤组织中ER/PR，分子类型成负相关，与临床分期，肿瘤大小，淋巴结转移，HER2表达、组织学类型无相关关系，肿瘤微环境中TH17细胞增多患者的DFS明显低于TH17细胞减少的患者(P＜0.01)，多因素分析显示TH17细胞水平与患者DFS负相关[(HR)2.24;95%CI 1.06～4.75][13]。本组研究结果显示，乳腺癌细胞中IL-17A表达显著高于癌旁正常组织，差异有统计学意义，IL-17A在有淋巴结转移患者的表达显著高于无淋巴结转移患者（P＜0.01），Ⅰ+Ⅱ期患者阳性率显著高于Ⅲ+Ⅳ患者，差异有统计学意义（P=0.014），IL-17A表达与年龄、肿瘤大小、肿瘤组织学分级，是否血管神经淋巴管侵犯，ER、PR表达差异无统计学意义，进一步证实了IL-17A可促进肿瘤发生、发展，可能与患者的预后有关。

IL-17可以刺激肿瘤微环境中的成纤维细胞，上调VEGF等多种血管形成因子的表达，刺激血管内皮细胞迁移促进血管生成。Wang M等[14]研究表明IL-17A/IL-17RA相互作用，促进小鼠骨肉瘤细胞分泌VEGF，MMP9和CXCR4，从而增加小鼠骨肉瘤转移机会。Hayata K[15]等利用siRNA腺病毒载体瘤内注射抑制IL-17A表达可显著抑制肿瘤组织中的CD31、基质金属蛋白酶-9和VEGF表达。乳腺癌小鼠模型中荷瘤小鼠微血管密度与IL-17在组织中的表达及血清水平成正比[16]。临床研究中多发骨髓瘤患者血清中VEGF和IL-17的水平较正常对照组明显增加，并且IL-17与VEGF呈正相关，VEGF可能刺激IL-17分泌，IL-17也可刺激VEGF分泌[10]。动物实验中输注IL-17A的肝癌组织有更高的微血管密度[9]。乳腺癌中TH17细胞可通过上调VEGF的表达刺激血管内皮细胞的迁移与聚集，促进肿瘤血管生成[11]。本研究结果表明，IL-17A、VEGF在乳腺癌中的表达显著高于癌旁正常组织，并且IL-17A与VEGF、微血管密度表达均呈正相关。IL-17A阳性表达组MVD显著高于IL-17A阴性表达组（P=0.000）。因此，IL-17A可能通过促进VEGF表达促进血管生存，最终促进肿瘤进展。Chung AS等[17]的研究显示，IL-17通过辅助性T细胞信号传递作用降低了小鼠模型中VEGF抑制型药物的活性，导致肿瘤抗血管治疗失效。因此，抑制IL-17的作用，可能提高VEGF靶向药物的临床疗效[17]。

综上所述，IL-17A的表达可能在乳腺癌的侵袭、转移中发挥着重要作用，乳腺癌中IL-17A高表达可能是通过促进VEGF表达增加血管密度，加速了肿瘤进展。

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Objective To investigate the expression of interleukin-17A（IL-17A） in breast cancer and to find out the relationship between the expression of IL-17A,VEGF and microvessel density. Methods The immunohistochemical method was used to detect the expressions of IL-17A，VEGF protein and the microvessel density of CD34 markers in 70 cases of breast cancer tissues and corresponding adjacent normal tissues, and their relationship with clinicopathological features were analyzed. Results The positive expression rate of IL-17A、VEGF and CD34 in breast cancer tissues was 78.6% (55/70)，68.6%（48/70）and 64.2%（45/70）, significantly higher than that in adjacent normal tissues of 24.3%（17/70），30.0% (21/70) and 31.4%（22/70）. The positive rate of IL-17A in cases with lymph node metastasis was significantly higher than that without lymph node metastasis（P=0.005）. The positive rate of IL-17A in Ⅲ+Ⅳ stages was significantly higher than that in Ⅰ+Ⅱstages（P=0.018）. There were no relationship between the expression of IL-17A and age, tumor diameter, histological grading, vascular nerve lymphatic invasion, PR and ER level. The expression intensity of IL-17A was positively correlated with VEGF and CD34 in breast cancer tissues（r=0.688, P=0.0032；r=0.724, P=0.0015）. MVD in positive expression of IL-17A group was higher than that in negative group（P=0.000）. Conclution The expression of IL-17A，VEGF，CD34 are high in breast cancer, IL-17A might affect breast cancer by promote VEGF expression in angiogenesis, IL-17A is expected to become a new target for anti-angiogenic therapy in breast cancer.

Breast neoplasms; IL-17A; Vascular endotheliel growet factor; Micro vessel density

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.35.002

山东 262400 山东昌乐县人民医院肿瘤科 （伦俊杰 孙建业 殷好治 滕祖栋） 广东 510095 广州医科大学附属肿瘤医院胃肠肿瘤外科 （余南荣）

殷好治 E-mail：sdyhz@163.com