姐妹胚胎囊胚形成率与卵裂期胚胎移植临床结局的相关性

朱杰，姜宏，何瑞冰，汪存利，殷慧群，李洋

（中国人民解放军第105医院生殖医学中心，合肥 230031）

延长胚胎培养时间至囊胚阶段行囊胚移植，能够进一步筛选出发育潜能高、染色体异常率低的胚胎，获得更高的胚胎种植率和更低的流产率［1-2］。然而，囊胚形成具有不确定性，约有60%的胚胎在囊胚培养过程中失败［3］。囊胚培养失败导致移植周期取消，对患者及医务人员带来极大的心理负担，并且囊胚移植的妊娠结局是否一定优于卵裂胚胎移植尚无定论［4］。有研究表明，卵裂期胚胎移植后，剩余姐妹（sibling）胚胎的囊胚形成率与其临床妊娠率存在正相关，认为移植卵裂胚可能与姐妹胚胎体外形成的囊胚具有相似的发育潜能［5-6］。本研究通过回顾性分析188个周期卵裂胚移植后，姐妹胚胎继续培养后囊胚形成与其临床结局的关系，并与266个囊胚移植周期进行比较，旨在探讨IVF-ET 过程中的胚胎移植策略以及姐妹胚胎继续培养后囊胚形成率对IVF-ET 临床结局的预测价值。

资料与方法

一、研究对象与分组

回顾性分析2013年1月至2014年7月在我院生殖中心实施IVF／ICSI-ET 的临床资料，共454个周期。本研究分为两组：将受精后第3天（D 3）卵裂胚移植后可利用胚胎行囊胚培养设为A 组（188个周期），行全囊胚培养并移植优质囊胚设为B 组（266个周期）。根据有无优质囊胚形成再将A 组分为优质囊胚形成组（A1组，127个周期），无优质囊胚形成组（A2组，61个周期）。纳入标准：均采用标准长方案或改良超长方案促排卵，女方年龄≤38岁，基础FSH ≤10 mU／ml，体重指数（BMI）：18.5～24.0kg／m2，无子宫畸形及输卵管积水，周期获卵数≥8枚，A 组和B组D 3均至少有5枚优质胚胎；卵裂胚移植后至少有5枚可利用姐妹卵裂胚行囊胚培养。患者夫妇在囊胚培养前均已告知风险并签署知情同意书。

二、研究方法

1.控制性促排卵：采用本中心的标准长方案或改良超长方案进行促排卵［7］。促排卵过程中根据血清LH、E2水平及卵泡发育速度调整Gn剂量，当至少有3个卵泡直径达18mm 时肌注重组人绒毛膜促性腺激素（rHCG，艾泽，Merck，德国）250μg，34～36h后经阴道超声引导下穿刺取卵。

2.胚胎培养、移植及临床结局：卵丘复合物充分洗涤后放入含血清蛋白的受精培养液（G-IVFPLUS，Vitrolife，瑞典）中，置37℃，6%CO2培养箱2～4h，根据精液参数实施常规IVF 或ICSI。次日评估卵母细胞受精情况，D3参照Cummins评分标准［8］进行胚胎质量评估。Ⅰ级：卵裂球匀称，无碎片或碎片＜5%；Ⅱ级：卵裂球较匀称，碎片≤20%；Ⅲ级：卵裂球不匀称，碎片20%～50%；Ⅳ级：卵裂球不匀称，碎片＞50%。本中心将D3 卵裂球数目≥5的Ⅱ级及以上胚胎和≥6的Ⅲ级及以上胚胎定义为可利用胚胎，其中卵裂球数目≥6的Ⅰ级胚胎和卵裂球数目≥7 的Ⅱ级胚胎定义为优质胚胎。达到囊胚培养标准后，对可利用胚胎行囊胚培养。将胚胎移入已平衡好的囊胚培养液中（G-2PLUS，Vitrolife，瑞典），置于37℃，5%CO2，90%N2和5% O2三气培养箱（Planer BT37，Origio，美国），培养至D5～D6，按照Gardner囊胚分级法［9］对囊胚进行评估，当培养D5的囊胚扩张≥3期，D6囊胚扩张≥4期，且内细胞团和滋养外胚层细胞评分均高于C级时为优质囊胚，未达到此标准为非优质囊胚。D3选择2～3 枚优质卵裂胚移植，D5 选择1～2 枚优质囊胚移植。移植14d 后，血清或尿HCG 检测阳性为生化妊娠，35d后超声检查显示宫内孕囊及胎心搏动为临床妊娠。

3.观察指标：分别比较3组的年龄、不孕年限、HCG 日子宫内膜厚度、平均获卵数、成熟卵数、正常受精率、卵裂率、D3优质与可利用胚胎数、优质胚胎率、移植胚胎数、异位妊娠率、流产率、周期取消率和临床妊娠率。周期取消率是指囊胚培养失败，周期取消的比率。另外还对囊胚形成率与卵裂胚移植临床妊娠率进行相关性分析。

三、统计学分析

结 果

一、3组间基本资料和临床结局比较

3组间年龄、不孕年限、HCG 日子宫内膜厚度、平均获卵数、成熟卵数、正常受精率、卵裂率、D3优质与可利用胚胎数，优质胚胎率，移植胚胎数、异位妊娠率，流产率和周期取消率均无统计学差异（P＞0.05），B组临床妊娠率（69.7%）和种植率（40.1%）均显著高于A2组（52.5%、28.2%）（P＜0.05），与A1组之间无统计学差异（P＞0.05）。A1组临床妊娠率和种植率与A2 组比较，无统计学差异（P＞0.05）（表1）。

二、囊胚形成率与卵裂胚移植临床妊娠率的关系

将总囊胚形成率及优质囊胚形成率按照0～≤10%、10%～≤20%…90%～≤100%划分为10个区间。直线回归分析显示，D3卵裂胚移植后囊胚总形成率及优质囊胚形成率均与临床妊娠率呈显著正相关（分别为r＝0.844和r＝0.867，P＜0.05）（图1、2）。

表1 3组间基本资料及临床结局比较［（±s），%（n）］

表1 3组间基本资料及临床结局比较［（±s），%（n）］

注：与A2组比较，＊P＜0.05

组 别 周期数 年龄（岁）不孕年限（年）HCG 日子宫内膜厚度（mm）获卵数（枚）成熟卵数（枚）正常受精率（%）A1组 127 28.9±4.1 5.1±4.0 11.2±2.1 15.3±6.2 13.1±4.8 78.7（1 563／1 987）A2组 61 29.4±4.3 5.0±3.8 11.7±2.2 16.1±5.5 12.6±3.5 79.5（678／853）B组 266 28.3±3.9 4.9±3.9 11.5±2.3 15.4±5.0 13.7±4.1 80.2（2 922／3 643）组 别 周期数 卵裂率（%） D3优质胚胎数（枚）D3可利用胚胎数（枚）D3优质胚胎率（%）移植胚胎数（枚）A1组 127 98.6（1 541／1 563） 7.3±2.1 9.6±2.1 66.3（1 021／1 541）2.0±0.3 A2组 61 98.2（666／678） 6.9±1.7 9.4±2.0 61.4（409／666） 2.1±0.4 B组 266 98.3（2 873／2 922） 7.2±2.0 10.1±2.3 68.9（1 981／2 873） 1.8±0.2组 别 周期数 临床妊娠率（%）种植率（%）异位妊娠率（%）流产率（%）周期取消率（%）A1组 127 63.8（81／127） 35.6（93／261） 3.7（3／81） 6.2（5／81）0 A2组 61 52.5（32／61） 28.2（37／131） 3.1（1／32） 9.4（3／32） 0 B组 266 69.7（182／261）＊ 40.1（202／504）＊ 3.8（7／182） 4.9（9／182） 1.9（5／266）

图1 姐妹胚胎总囊胚形成率与临床妊娠率的相关分析

图2 姐妹胚胎优质囊胚形成率与临床妊娠率的相关性分析

讨 论

近年囊胚移植的比例逐年上升，Marsh等［10］一项60余万例IVF 周期回顾分析显示，囊胚移植占比从2001年的12%上升至2009年的36%，而同期卵裂胚移植比例则从77%下降至55%。有报道完全扩张且高评分的囊胚具有较高的种植率，荟萃分析显示囊胚移植可显著提高胎儿出生率并降低流产率［1，2，11］。本研究的结果也证实新鲜周期囊胚移植的胚胎种植率和临床妊娠率高达40.1%和69.7%，显著高于无优质囊胚形成的卵裂胚移植28.2%和52.5%。虽然各生殖中心越来越多采用囊胚移植，但是我们仍要对这项技术保持一定谨慎。Bu等［12］在一项多中心、大样本研究中发现，囊胚移植组男婴出生比例显著高于卵裂胚移植组，该结论也在其它报道得到证实［13-14］，并且囊胚移植较卵裂胚移植增加了婴儿早产及先天畸形的发生概率［15］。

临床上医生常根据患者的年龄、不孕类型（原发或继发）、D3 优质胚胎数、既往IVF 周期情况及激素水平等决定选择卵裂胚移植或囊胚移植。囊胚移植周期常为女方年龄轻（≤35岁），或IVF反复种植失败，以及D3天有4～5 枚以上优质胚胎者，而对于一些胚胎数量少质量较差且年龄较大者常选取D3卵裂胚移植。由于在胚胎移植前已人为干扰而非随机性，因此两者临床结局的比较常存在偏性。Kang等［16］的结果表明，当女方＜37岁且子宫内膜厚度＞8mm 时，优质单卵裂胚移植与单囊胚移植在临床妊娠率、种植率、持续妊娠率及出生率间并无显著差异。本研究的结果显示，D3移植后剩余姐妹胚胎有优质囊胚形成的卵裂胚移植可获得与D5囊胚移植相近的临床妊娠率和种植率，提示当移植具有高发育潜能的卵裂胚时可获得与移植囊胚相似的临床结局。

目前胚胎体外培养体系仍在不断完善中，尚不能完全模拟母体的微环境，体外囊胚培养失败并不代表胚胎不能在体内发育形成囊胚。本研究中尽管我们采取了较高的囊胚培养标准（D3 优质胚胎≥5枚），但在266个囊胚培养周期中，仍有5 个周期完全失败的案例，虽然发生几率仅有1.9%，与卵裂胚移植比并无显著性差异，但患者情感上仍难以接受本可在D 3移植优质卵裂胚，培养至D5 无可移植胚胎的痛苦结局，并有可能由此引起医疗纠纷。因此，在D3选择质量较好的卵裂胚移植后行姐妹胚胎囊胚培养不仅可保证患者有胚胎可移植，获得与囊胚移植相似的临床结局，而且新鲜周期移植失败，冻融囊胚移植仍可取得较满意的临床结局［17］。

本研究通过直线回归分析姐妹胚胎囊胚形成率与临床妊娠率的相关性证实，姐妹胚胎总囊胚形成率及优质囊胚形成率均与临床妊娠率呈显著正相关，表明姐妹胚胎的囊胚形成率与移植胚胎的发育及植入潜能相关，可通过姐妹胚胎的囊胚形成率预测卵裂胚移植的临床结局。

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