二去水卫矛醇对人卵巢癌细胞的体外抑制作用

周　莹，刘华钢，苏桂玉，彭晓丽

（1.广西医科大学，广西 南宁　530022；2.广西中医药大学，广西 南宁　530001）

二去水卫矛醇对人卵巢癌细胞的体外抑制作用

周莹1，刘华钢1，苏桂玉2，彭晓丽2

（1.广西医科大学，广西 南宁530022；2.广西中医药大学，广西 南宁530001）

［目的］研究二去水卫矛醇（1，2：5，6-dianhydroga-lactitol，DAG）对人卵巢癌细胞A2780和SKOV3增殖的抑制作用。［方法］采用噻唑蓝（MTT）比色法和CCK-8（cell counting kit-8）法检测不同浓度DAG对人卵巢癌细胞A2780和SKOV3的体外抑制作用，观察DAG的半数抑制浓度。［结果］MTT法检测结果显示，DAG对人卵巢癌细胞A2780、SKOV3作用72 h后半数抑制浓度（72 h-IC50）分别为19.97 μg/ml、22.57 μg/ml；而CCK-8法检测结果显示，DAG对人卵巢癌细胞A2780、SKOV3作用72 h后72 h-IC50分别为15.15 μg/ml、16.15 μg/ml。显微镜下可见DAG 72 h作用后细胞圆缩、胞质浓缩、胞浆内颗粒集中边缘化甚至细胞溶解等损伤现象。［结论］DAG在体外对人卵巢癌细胞A2780和SKOV3均有抑制生长作用。

二去水卫矛醇；人卵巢癌细胞；噻唑蓝试验；CCK-8法；半数抑制浓度

二去水卫矛醇（1，2:5，6-dianhydroga-lactitol，DAG）是以从卫矛科植物蜜花美登木（Maytenus confertiflorus J.Y.Lao ex X.X.Chen）中分离出的卫矛醇［1］（dulcitol）为原料，经溴化、消除反应而制得的1，6-二溴卫矛醇（1，6-dibromidulcitol）的双环氧化物，是新型的植物生物碱类抗肿瘤药，它与烷化剂形成交叉耐药，结构上可归为烷化剂类，为广谱抗肿瘤药物，具有毒性小、易溶于水、抗肿瘤活性高等优点。早期临床试验表明，DAG对慢性粒细胞白血病、肺癌、原发性脑瘤、人胃癌细胞、人鼻咽癌细胞、人肺癌细胞、肾上腺肿瘤、膀胱癌、胃肠道肿瘤实体瘤等均有抑制作用［2-7］。另外，还有研究表明DAG是周期非特异性药物，它可以与某些周期特异性药产生协同作用［8］。而DAG对人卵巢癌抑制作用及分子机制的研究在国内外尚未见详尽报道。为此，本实验通过噻唑蓝（MTT）比色法和CCK-8法检测DAG对人卵巢癌的体外抗肿瘤活性，为扩大其抗瘤谱及进一步进行结构改造、分子机制研究提供依据。

1　材料与方法

1.1药物与细胞株二去水卫矛醇由广西梧州制药（集团）股份有限公司提供，临用前用完全培养基液配成所需浓度；RPMI 1640、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶溶液均购于赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L）是福州迈新生物技术开发有限公司产品；青链霉素混合液（100 U/ml）和噻唑蓝（MTT）均是北京索莱宝科技有限公司产品；CCK-8溶液是上海尚宝科技有限公司产品；人卵巢癌细胞A2780和SKOV3购自中科院上海细胞库。

1.2主要仪器设备CO2培养箱（Thermo Fisher scientific，USA）；酶标仪（Tecan Austria GmbH）；倒置显微镜（重庆光学仪器厂出品）。

1.3细胞的培养先配好含10%胎牛血清和青链霉素混合液（终浓度为青霉素100 IU/ml，链霉素100 μg/ml）的RPMI 1640完全培养液，然后用此完全培养液于37℃、5%CO2培养箱中培养人卵巢癌细胞A2780和SKOV3，细胞贴壁生长，隔天换液，待细胞长至覆盖瓶底的80%左右时，用0.25%胰蛋白酶溶液消化传代。取状态良好的长至对数生长期的细胞用于后续细胞增殖抑制实验。

1.4MTT试验方法收集对数生长期的A2780和SKOV3细胞，调整细胞密度，以每孔100 μl、5×103个细胞接种于96孔板里，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，以细胞培养基为空白对照，A2780、SKOV3细胞的其他组分别加入6 μg/ml、12 μg/ml、24 μg/ml、48 μg/ml、96 μg/ml DAG完全培养液100 μl，同时每组设5个复孔，处理完后置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养72 h后，倒置显微镜下观察细胞形态，并于每孔中加入20 μl的MTT溶液，放入CO2培养箱中继续培养4 h，弃去培养液，每孔加入150 μl DMSO溶液显色，振荡10 min，使孔内溶液颜色均匀，于570 nm波长酶标仪测定吸光度值（OD）。实验重复3次，取平均值为最终结果。按下式计算细胞增殖抑制率:

细胞增殖抑制率=1-实验组平均OD值/空白对照组平均OD值×100%，计算细胞生长抑制达50%的DAG浓度，以72 h-IC50表示。

1.5CCK-8试验方法细胞处理情况与MTT法相似，待培养细胞，给药处理72 h后，同样于倒置显微镜下观察细胞形态，将每孔培养液混合均匀，吸出100 μl弃去，并于每孔中加入10 μl的CCK-8溶液，放入CO2培养箱中继续培养，待1.5 h后观察显色情况，于450 nm波长酶标仪测定吸光度值（OD）。实验重复3次，取平均值为最终结果，计算细胞增殖抑制率。

2　结果与分析

2.1两种方法测定结果MTT法测定不同浓度DAG对A2780及SKOV3细胞作用72 h后的OD值及细胞增殖抑制率见表1，CCK-8法测定不同浓度DAG对A2780及SKOV3细胞作用72 h后的OD值及细胞增殖抑制率见表2。通过SPSS19.0软件计算DAG对两种细胞的半数抑制浓度（IC50）值。表1、表2结果看出，经不同浓度DAG作用72 h后，上述实验组的OD值与空白对照组相比均呈下降趋势，且有明显的浓度-效应关系。说明DAG对以上两株人卵巢癌细胞均有抑制生长作用。两种测定方法的结果显示，CCK-8法的灵敏度和准确度较高，且重复性优于MTT法。

表1　MTT法测定不同DAG浓度对人卵巢癌细胞A2780、SKOV3细胞增殖的影响　（±s，n=5）

表1　MTT法测定不同DAG浓度对人卵巢癌细胞A2780、SKOV3细胞增殖的影响　（±s，n=5）

DAG （μg/ml）A2780 OD　抑制率（%）SKOV3 （μg/ml）　OD　抑制率（%）72 h-IC5072 h-IC50（μg/ml）0 1.35±0.02　0.00　1.60±0.04　0.00 1.02±0.03　0.24　1.23±0.03　0.23 12　0.89±0.04　0.34　19.97　1.19±0.02　0.26　22.57 24　0.65±0.03　0.51　0.94±0.02　0.41 48　0.24±0.03　0.82　0.50±0.03　0.69 96　0.01±0.01　0.99　0.09±0.02　0.94 6

表2　CCK-8法测定不同DAG浓度对人卵巢癌细胞A2780、SKOV3细胞增殖的影响　（±s，n=5）

表2　CCK-8法测定不同DAG浓度对人卵巢癌细胞A2780、SKOV3细胞增殖的影响　（±s，n=5）

A2780　SKOV3 DAG （μg/ml）OD　抑制率（%）72 h-IC50（μg/ml）OD （μg/ml）抑制率（%）72 h-IC50（μg/ml）0 0.88±0.01　0.00　1.09±0.01　0.00 0.66±0.01　0.25　0.85±0.00　0.22 12　0.46±0.02　0.47　15.15　0.64±0.01　0.41　16.15 24　0.25±0.01　0.71　0.40±0.01　0.63 48　0.12±0.02　0.86　0.20±0.02　0.81 96　0.03±0.01　0.96　0.12±0.01　0.89 6

2.2细胞形态观察结果DAG作用于A2780和SKOV3细胞72 h后，在倒置显微镜下观察，各实验组细胞均不同程度出现贴壁能力减弱、细胞圆缩、胞质浓缩、胞浆内颗粒集中边缘化甚至细胞溶解等损伤现象，而空白对照组细胞均生长良好，细胞形态完整，胞质透亮。

3　结论

本文初步探讨了DAG对人卵巢癌细胞的体外抑制作用，结果表明，DAG对A2780、SKOV3两株人卵巢癌细胞均有抑制生长作用，且具有明显的浓度-效应关系。但DAG诱导人卵巢癌细胞凋亡所发生的基因、蛋白表达谱变化，体内抑制人卵巢癌效果等有待于下一步深入研究，以便于发现新的作用靶点，对其进行相应的结构改造，开发抗肿瘤靶向制剂。

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［4］Eagan R T，Ingle J N，Frytak S，et al.Platinum-based polychenmotherapy versus dianhydrogalactitol in advanced nonsmall cell lung cancer［J］.Cancer Treat Rep，1977，61（7）: 1339-1345.

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［8］Fan Y J，Zhou J，Li M，et al.Experimental study of 1，2: 5，6-dianhydrogalactitol and maytenus on combinations［J］. Acta Pharmaceutica Sinica，1983，18（9）:648-652.

（编辑陈明伟）

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2095-4441（2015）04-0066-02

2015-10-22