槟榔仁对KM小鼠的急性毒性研究

刘书伟等

摘要：为研究口服槟榔（Areca catechu Linnaeus）仁汁液的毒性，进行了小鼠的经口急性毒性试验。根据预试验确定正式试验给药剂量的范围，选用KM小鼠经口灌胃，一次给药，给药后连续观察7 d，记录小白鼠的中毒反应及死亡情况，采用寇氏法计算 LD50及LD50的95%可信限。结果表明，高剂量给药组小白鼠出现中毒反应并死亡，解剖后检查发现主要原因是胃肠和肺部的病变，测得槟榔仁汁液的LD50及LD50的 95%可信限分别为12.425 g/（kg.bw）、10.610～14.551 g/（kg.bw），表明槟榔仁汁液可以被认为是实际无毒物质。槟榔仁原液干物质的LD50及LD50的95%可信限分别为1.349 g/（kg.bw）、1.152～1.580 g/（kg.bw），属于低毒物质。

关键词：槟榔（Areca catechu Linnaeus）仁；小鼠；急性毒性；半数致死量

中图分类号：R992 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）18-4532-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.035

槟榔（Areca catechu Linnaeus）又称宾门、仁频、洗瘴丹、国马、大腹子、橄榄子、榔玉、青仔、海南子等，为棕榈科槟榔属的多年生常绿乔木植物。槟榔位居中国四大南药（槟榔、砂仁、益智、巴戟）之首，它味苦、性辛、温，归胃、大肠经，具有杀虫消积、降气、行水、截疟的功效，入药历史悠久，疗效确切，是中医常用的驱虫、消积药物。槟榔全身都是宝，其未成熟的果实（槟榔）、雄花蕾（槟榔花）、果皮（大腹皮）、种子（槟榔仁）均可入药[1，2]。槟榔咀嚼的习俗由来已久[3]，但长期大量嚼食槟榔，除可能罹患口腔疾病、口腔癌外，食用过量会产生中毒症状，如兴奋、眼神呆滞、全身发抖、走路不稳、行为怪异或粗暴、心律不齐和心肌梗死等。2003年世界卫生组织国际癌症研究中心认定槟榔为一级致癌物[1，4，5]。目前，在中国槟榔作为嗜好食品的咀嚼方式有两种，一种是以海南和台湾为代表的槟榔鲜果咀嚼方式，该方式咀嚼的为全槟榔，包含槟榔仁和大腹皮。另一种是以湖南为代表的不含槟榔仁的槟榔干果咀嚼方式，以湖南湘潭为代表的槟榔加工地区把槟榔晒干或烘干后制成槟榔干果，为了防腐，剔除了槟榔仁和采用烟熏工艺的干果加工工艺。但是，嗜好槟榔的海南人和台湾人认为干果槟榔失去了新鲜槟榔的特有口感，所以，尽管湖南加工的槟榔干果比较方便和卫生，但是海南和台湾本土人还是更多地选择咀嚼含有槟榔仁的槟榔鲜果。随着槟榔的食用安全性越来越受到全社会的关注，国内外众多学者对槟榔毒理进行了大量的研究[6-9]。但是针对槟榔仁的毒性状况尚未见报道，为了评价槟榔仁的安全性及更系统地研究其药理作用，特进行了槟榔仁原液对小白鼠经口急性毒性试验，测定其半数致死量（LD50），从而确定该物质的急性毒性强弱。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 试验动物采用SPF级KM小白鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，小鼠生产许可证号：SCXK（湘） 2013-0004。全部动物引入后，置于海南三亚市功能槟榔研究重点实验室动物房养殖，饲养室的室温为（22±3） ℃，相对湿度为60%～70%，12 h光照。以SPF级小鼠专用维持饲料雌雄分笼喂养，自由饮水采食，适应7 d，在小鼠适应的过程中，观察小鼠的综合状况，选取表现正常和大小均匀一致的小鼠待用，体重（20±1） g，雌雄各半，雌性小鼠未产未孕。

1.1.2 槟榔果实标准及槟榔仁原液制备 试验所使用的槟榔采摘于海南省三亚市吉阳区农民的槟榔种植园。采收标准为：外形为长椭圆形或椭圆形，果实匀称，茎部带宿萼，剖开果皮内有未成熟瘦长形种子，光泽较好、颜色纯正的适于嚼食的槟榔青果，横向直径3～4 cm，纵向直径5～6 cm。采摘后用保鲜膜包裹，及时运到实验室，放冰箱冷藏待用。

取待用新鲜优质槟榔，剖开果皮取槟榔仁，压榨取汁液，放入经消毒后的离心管，以5 000 r/min离心10 min，上清液经0.22 μm除菌过滤膜过滤，滤液即为供试槟榔仁原液，无团聚现象，纯度100%，现用现榨。

1.2 试验方法

1.2.1 经口急性毒性试验预试验 按照GB15193.2-2014《食品毒理学实验室操作规范》进行试验，选取健康小白鼠60只，雌雄各半，随机分为6个组，每组10只，禁食6 h后按体重比例灌胃给药，给药后禁食1 h。给药方法：将槟榔仁原液用蒸馏水稀释后，按等差数列从小到大配成不同浓度的稀释液，分6个剂量组，每组每个剂量按照剂量大小分为一次性灌胃给药和二次给药，单次灌胃剂量标准为25 g/（kg·bw），控制每次最高给药0.5 g，超过0.5 g的部分采用间隔2 h后二次给药。给药后观察7 d，观察小鼠中毒症状并记录死亡数。经反复预试验，最后得出预试验中最理想的给药量，由于采用灌胃量标准为槟榔仁稀释液25 g/（kg·bw），6个组折算成槟榔仁原液的给药量分别为1.5、3.0、6.0、12.0、24.0、48.0 g/（kg·bw）。根据预试验结果确定能使小鼠全部死亡的最小剂量（LD100）为24.0 g/（kg·bw），能使小鼠全部存活的最大剂量（LD0）为6.0 g/（kg·bw）。

1.2.2 正式试验 根据预试验结果设计正式试验。将60只小鼠随机分成6组（5个试验组+1个对照组），每组各10只，雌、雄各半并编号。试验前禁食6 h，自由饮水，试验组根据预试验计算给药量（表1），对照组按25 g/（kg·bw）灌胃蒸馏水。对6组小鼠一次性灌胃，给药后单笼饲养，继续禁食1 h。给药后的前3 h每隔30 min观察1次小鼠的采食、饮水、被毛、活动、精神、症状起始时间和持续时间、死亡情况；之后每隔2 h观察1次；2 d后，每天观察3次。对死亡小鼠及时解剖记录病变情况，在第八天将所有存活的小鼠采用脊椎脱臼法处死并解剖，观察腹腔内的液体状况和实质性器官的病理变化。

2 结果与分析

2.1 预试验结果

根据反复预试验确定槟榔仁原液的LD0和LD100分别为6.0 g/（kg·bw）和24.0 g/（kg·bw），根据公式r= ■[r为相邻两组剂量的比值；a为最大剂量24.0 g/（kg·bw）；b为最小剂量6.0 g/（kg·bw）；n为预分组数]，计算得r=1.414 2。

2.2 正式试验结果

根据预试验的结果，由r=1.414 2确定5个试验组的给药剂量分别为6.000、8.485、12.000、16.971、24.000 g/（kg·bw），按照GB15193.2-2014中的寇氏法要求计算LD50及其95%可信限。LD50计算公式为：

lgLD50=XK-d（∑p-0.5）

式中，XK为最大剂量组剂量的对数值；d为剂量间比值的对数值；∑p为各组死亡率之和，以小数表示。然后可算出LD50的95%可信限X，计算公式为：X=lg-1[lgLD50±1.96SlgLD50]。

计算得LD50=12.425 g/（kg·bw），LD50的95%可信限是10.610～14.551 g/（kg·bw）。根据化合物经口急性毒性分级标准[10]，槟榔仁汁液属于2级毒性，即实际无毒物质，大约相当于体重70 kg人的致死剂量为350～1 050 g。

在本试验中，为了进一步确定槟榔仁的食用安全情况，剖开新鲜槟榔取仁压榨获取槟榔仁原液，取17.942 g槟榔仁原液在60 ℃恒温烘箱烘干后得干物质1.948 g，得出槟榔仁原液干物质占原液的10.86%，根据上述寇氏半数致死量计算方法，槟榔仁原液干物质半数致死量为：LD50=1.349 g/（kg·bw），LD50的95%可信限为1.152～1.580 g/（kg·bw）。根据化合物经口急性毒性分级标准[10]，槟榔仁原液干物质属于3级毒性，即低毒，大约相当于体重70 kg人的致死剂量为35～350 g。

2.3 给药后小鼠临床症状及解剖病理变化

灌胃后，高剂量组小鼠表现拱背，全身颤抖，翘尾，呼吸急促，躁动不安，之后闭眼，眼球浑浊、黯淡，精神沉郁，呼吸短促，体温偏低，流涎，懒动，腹胀，协调性差等现象。随着时间的推移，症状加重，尾巴青紫，被毛凌乱，给药30 min后开始出现死亡。但临床表现出现时间不同，剂量越高出现症状的时间越短，耐过的受试小鼠逐渐恢复正常；低剂量组小鼠无显著变化，活动量减少；对照组小鼠活跃，在笼中来回走动，似觅食状。各剂量组动物的毒性反应强度与剂量呈正相关。

死亡的小鼠被毛凌乱、无光泽，尾巴、四肢青紫，眼球塌陷。对死亡小鼠进行解剖，可见胸腔有出血现象，胃部和肠道充气膨大，有气泡，肠壁变薄、半透明，尾静脉发黑，部分小鼠肺脏苍白，其他器官未见明显可眼观的病变。但急促死亡的小鼠内脏除胃部和肠道充斥大量气泡外，无可眼观病变。

2.4 给药后不同时间小鼠的死亡率

小鼠死亡时间为给药后0.5～28.0 h，死亡集中时间在给药后0.5～4.0 h。正式试验受试的60只小鼠共死亡24只，给药后0.5～4.0 h内死亡21 只，4.0～8.0 h内死亡2只，8.0～28.0 h死亡1只，分别占87.5%、8.3%和4.2% ，给药28.0 h后不再出现死亡，耐过的受试小鼠逐渐恢复正常。同时给药3.0 h后开始逐渐恢复饮食欲的小鼠，饮食后被毛及活动亦逐渐恢复正常，之后没有死亡；若不恢复饮食欲的小鼠，将会在3.0～28.0 h内逐渐死去。

3 小结与讨论

经口急性毒性试验是药物毒理学安全性评价的第一步，具有了解受试物急性毒性强弱的作用。LD50是检测物质急性毒性的经典指标，稳定性好，敏感度高。LD50数值越大，则表明受试物急性毒性越弱、越小；反之，急性毒性就越强、越大[11]。本试验结果表明， 槟榔仁原液对小鼠经口LD50为12.425 g/（kg·bw），LD50的95%可信限为10.610～14.551 g/（kg·bw），按毒性分级标准属于实际无毒的药物。槟榔仁原液干物质半数致死量为1.349 g/（kg·bw），LD50的95%可信限是1.152～1.580 g/（kg·bw），按毒性分级标准属于低毒物质。

在海南省，嗜好咀嚼新鲜槟榔者，1 d中咀嚼槟榔数约3～30颗不等，从中获取的槟榔仁的汁液量约10～100 g，此外在嚼食槟榔时最初几口的汁液吐掉不吞服，因槟榔仁较嫩咀嚼易出汁液，所以吐出的主要是槟榔仁汁液，就槟榔仁1 d的食用量来说是安全的。该试验还表明，试验动物死亡时间集中在给药后0.5～8.0 h内，未死亡的动物在给药后3.0 h出现饮食欲，症状也逐渐缓解，说明槟榔仁汁液起效快，代谢快，但其在体内的吸收、分布、生物转化和排泄的药代动力学的机理需进一步研究。同时在此次急性毒性试验中发现，给予高剂量的槟榔仁汁液时，小鼠出现明显的全身震颤、眼球浑浊、躁动不安、协调性差等现象，这与人食用过量槟榔后的表现一致，所以可能是槟榔仁的作用导致嚼食槟榔产生毒副作用的根源，但具体的成分还需进一步探究。

参考文献：

[1] 赵国祥，岳建伟，张光勇.槟榔的研究开发状况及市场发展前景[J].中国热带农业，2006（6）：17-18.

[2] 卢丽兰，甘炳春，许明会，等.不同生长状况下槟榔叶片Na+与Cl-含量调查及分析[J].中国农学通报，2013，29（9）：75-79.

[3] 黛安·乌梅穆托.红唾液和黑牙齿[J].世界博览，1984（4）：34.

[4] GILANI A H，GHAYUR M N，SAIFY Z S，et al. Presence of cholinomimetic and acetylcholinesterase inhibitory constituents in betel nut[J]. Life Sci，2004，75（20）：2377-2389.

[5] CHANG Y C，HU C C，TSENG T H.Synergistic effects of nicotine on arecoline-induced cytotoxicity in human buccal mucosal fibroblasts[J]. Journal of Oral Pathological Medicine，2001，30（8）：458-464.

[6] 李 明，彭解英，吴颖芳，等.槟榔碱诱导上皮细胞凋亡[J].国际病理科学与临床杂志，2011，31（4）：282-285.

[7] CHATTEIJEE A，DEB S. Genotoxic effect of arecoline given either by the peritoneal or oral route in murine bone marrow cells and the influence of N-acetylcysteine[J]. Cancer Letters，1999，139（1）：23-31.

[8] 林富煌，申慕韩，林石化，等.嚼槟榔对肾脏的影响[J].台湾家庭医学杂志，2001，11（2）：66-77.

[9] CHOU C Y，CHENG S Y，LIU J H，et al. Association between betel-nut chewing and chronic kidney disease in men[J]. Public Health Nutrition，2008，12（5）：723-727.

[10] 沈建忠.动物毒理学[M].北京：中国农业出版社，2002.

[11] 张 铣，刘毓谷.毒理学[M].北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合山版社，1997.