一种从非变性聚丙烯凝胶中回收小片段DNA的方法

向小华焦禹顺吴新儒程亚增侯烁，3刘贯山王元英

（1.中国农业科学院烟草研究所　中国农业科学院烟草遗传改良与生物技术重点开放实验室，青岛　266101；2.中国农业科学院研究生院，北京， 100081；3.青岛农业大学农学与植物保护学院，青岛　266109）

一种从非变性聚丙烯凝胶中回收小片段DNA的方法

向小华1，2焦禹顺1，2吴新儒1程亚增1，2侯烁1，3刘贯山1王元英1

（1.中国农业科学院烟草研究所中国农业科学院烟草遗传改良与生物技术重点开放实验室，青岛266101；2.中国农业科学院研究生院，北京， 100081；3.青岛农业大学农学与植物保护学院，青岛266109）

利用高分辨率的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、纯化特异性小片段DNA的首选方法，也是开展后续多种分子生物学试验的前提。本试验比较了改良煮沸法（液氮研磨+煮沸+低温浓缩）、煮沸法及直取法回收小片段DNA，以回收样品模板进行第二次PCR扩增，结果表明：改良方法回收的DNA 的纯度高，特异性好，回收率与经典煮沸法相当。在保证回收产物的特异性时，用低温浓缩法替代乙醇/醋酸钠共沉淀也具有可行性及一定的创新性。

非变性聚丙烯凝胶；DNA小片段；二次PCR；改良煮沸法；胶回收

在生命科学飞速发展的今天，对于生命的探索已深入到分子水平。在分子生物学试验中，对PCR扩增获得的目的DNA 片段进行回收和纯化，除去非特异性的DNA 片段，进行后续研究是一个必不可少的环节。鉴于琼脂糖凝胶电泳的分辨率相对较低，尤其是回收片段大小在50 bp的DNA片段 时存在较大的局限性［1，2］，借助于分辨率更高的聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）回收纯化小片段DNA，具有操作简单、回收纯度高、价格经济、同时可操作回收多个样品等优点，现已被广泛应用于小片段DNA 的回收纯化［3，4］。目前有几种常用的回收方法［5-7］，在市场上也有知名生物试剂公司开发了相应的回收纯化试剂盒，但这些回收方法都表现出经济成本与高效性不可兼得的矛盾。因此，探索一种操作相对简单、回收效率较高、回收成本较低的实用方法尤为重要。本研究在前人研究的基础上［8-10］，通过液氮研磨增加PAGE凝胶的破碎度，利用煮沸法从非变性聚丙烯酰胺凝胶中最大程度地释放、回收纯化目的DNA 片段并结合低温浓缩的方法，并将回收后的DNA 用于第二次PCR的模板，再与常规直取法的结果进行比较，旨在验证这种纯化方法的实用性和可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 植物材料为中烟100经过EMS诱变处理得到的白茎突变体（Mutant，M）［11］和野生型中烟100（Wild type，WT）的种子各30粒，由中国农业科学院烟草研究所刘贯山研究员提供。种子经常规消毒培养4周后进行假植，待材料生长到5-6片真叶时，取材料的新鲜叶片提取基因组DNA，进行后续试验。

1.1.2 试剂 30%丙烯酰胺储液（丙烯酰胺∶N，N'-亚甲叉双丙烯酰胺=29∶1）；双蒸水；10%过硫酸铵（APS）；10×TBE；1×TBE Buffer；TEMED；20 bp DNA Ladder Marker（TaKaRa）；亲和硅烷，剥离硅烷，植物基因组DNA提取试剂盒（Tiangen），特异性SSR引物PT51778，Thermor PCR mix（内含：Taq酶、dNTPs、Mg2+，Reaction Buffer、Loading Buffer）。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 参照试剂盒提供的步骤提取材料的基因组DNA，具体操作步骤如下：（1）取烟草新鲜叶片组织0.1 g，加入液氮充分研磨，每个样品3个重复。（2）将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（试验时现加β-巯基乙醇，使终浓度达0.1%），迅速颠倒混匀后，65℃温育20 min，期间颠倒混匀3-4次。（3）加入700 μL氯仿，充分混匀，12 000 r/min离心5 min。（4）取上清液转入一新的离心管中，加入700 μL缓冲液GD2，充分混匀。（5）将混匀的液体转到吸附柱CB3中，12 000 r/min离心30 s，弃掉废液。（6）向吸附柱中加入500 μL缓冲液GD，12 000 r/min离心30 s，倒掉废液。（7）向吸附柱中加入600 μL漂洗液PW，12 000 r/min离心30 s，倒掉废液。（8）重复步骤（7）。（9）将吸附柱放入收集管中，12 000 r/min离心2 min，倒掉废液。将吸附柱于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中的漂洗液。（10）将吸附柱置于另一干净的离心管中，加入100 μL TE，室温放置2-5 min，12 000 r/min离心2 min，将溶液收集到离心管中，并进行定性定量检测。

1.2.2 PCR 扩增目的片段 使用Bio-Rad PCR仪C1000进行DNA片段扩增。10 μL反应体系包括：2×Thermor supermix 5 μL，正反向引物（10 μmol/L）各0.6 μL，模板DNA 2 μL，50 ng，加ddH2O至反应体积为10 μL。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃后延伸10 min，产物4℃保存备用。

1.2.3 目的片段的非变性PAGE检测 6%非变性PAGE胶的制备参照《分子克隆技术指南（第3版）》［12］，待凝胶完全凝聚后，于电泳槽中加入足量的1×TBE 缓冲液60 W预电泳15 min，取4 μL PCR产物进行60 W恒功率电泳检测，电泳至指示剂二甲苯青接近胶板2/3 处停电泳。

1.2.4 凝胶的硝酸银染色显示 电泳结束后，凝聚染色按照朱丹等［13］报道的方法加以改进。具体步骤如下：（1）水洗：将凝胶板放入含1 L去离子水的染色盘中，再漂洗30 s。（2）银染：在盘中加入1 L蒸馏水，1.5 g AgNO3和1 mL甲醛，120 r/min振荡10-15 min。（3）水洗：取出染色板，在1 L蒸馏水中快速荡洗十几秒。（4）显影：在1 L冷的显影液（1000 mL蒸馏水+16 g NaOH+4-5 mL甲醛）中振荡，然后将盆放在摇床上轻轻摇动至条带清晰显现，直至条带出现，终止显影并用去离子水润洗胶面3-4次。

1.2.5 PAGE胶中差异条带的回收

1.2.5.1 直取法 参照陈亮等［14］方法进行。在胶湿润时直接使用无菌的10 μL枪头在聚丙烯酰胺凝胶的目标条带的同一位置上轻扎1-3次，在PCR反应液中反复吸打，以枪头上沾有的小胶块作为PCR反应的DNA模板，重复2-3个PCR反应以避免模板未转移到管中的情况。

1.2.5.2 煮沸法 参照文献［15，16］进行。切下目的条带，取等量的凝胶分别放入两个无菌离心管中，向保留有凝胶的离心管中用100 μL双蒸水清洗两遍后吸干残留液，用无菌枪头尖将凝胶碾碎，在含有凝胶的离心管中加入100 μL双蒸水，100℃煮沸15 min，12 000 r/min离心5 min后，将上清液（DNA粗回收液）移至一新的离心管中。参照文献［15］的方法步骤进行纯化回收，在上清液加入2 倍体积预冷的无水乙醇和1/10体积3 mol/L的醋酸钠（pH5.2），-20℃放置1 h；4℃，12 000 r/min离心20 min，吸弃上清；用75%乙醇洗涤沉淀2 次；4℃，12 000 r/min离心2 min，吸弃上清；待乙醇挥发干净后，用双蒸水溶解沉淀，取5 μL用作PCR模板进行扩增，取5 μL扩增产物进行电泳检测。

1.2.5.3 改良的煮沸法 切下目的条带，取等量的凝胶分别放入两个无菌离心管中，向保留有凝胶的离心管中用100 μL 双蒸水清洗两遍后吸干残留液。在吸干水分的凝胶中2 mL离心管中加入两颗干净的钢珠，置于液氮中5 min左右，在植物组织破碎仪上研磨（频率为1 000 Hz/min），使凝胶呈粉末状，后在管中加入100 μL双蒸水，98℃煮沸15 min。后在室温放置30 min，以12 000 r/min 离心10 min，取上清液于新离心管中，将离心管放置在浓缩仪中低温（4℃）浓缩至液体体积为30 μL时，测定浓度，并取5 μL做为PCR反应的模板进行扩增，取5 μL PCR扩增产物进行电泳检测。

2 结果

2.1 烟草基因组DNA的提取

1%琼脂糖凝胶电泳结果表明，提取的烟草基因组DNA条带单一，无弥散现象，且一致性较好（图1）。紫外分光光度计测定结果表明，所提取的DNA的OD260/OD280基本在1.7-1.9之间，没有超出2.0，说明提取的DNA中没有蛋白质、酚污染；且OD260/OD230基本都在1.9-2.1之间，表明DNA纯度较高，没有小分子污染。综上分析，提取的烟草基因组DNA符合后续实验要求。

图1 1%琼脂糖检测基因组DNA

2.2 目的DNA的获取

SSR引物PT51778在烟草野生型和突变体中的PCR 扩增产物通过1% 的琼脂糖胶电泳检测的结果（图2-A）显示，目的DNA 片段（大小在100-200 bp之间）得到了有效扩增。利用1% 琼脂糖凝胶电泳结果显示，除了目的条带以外没有展示出非特异性扩增的条带。但利用6%非变性聚丙烯凝胶电泳检测，除目的条带外，还有一些大小不等的非目的条带（图2-B），这也验证了非变性聚丙烯凝胶的分辨率高于普通琼脂糖凝胶。

图2 1%琼脂糖（A）和6%非变性聚丙烯凝胶（B）电泳检测PCR扩增产物

2.3 不同回收DNA方法的比较

将目的条带从非变性凝胶上切下按照不同方法回收，取回收产物为模板经PCR二次扩增。结果显示，3种方法回收的目的片段的扩增产物均获得了预期大小（150 bp 左右）的目的片段，这进一步验证了试验选用的方法对于回收DNA小片段具有的可行性。但比较不同方法之间的回收产物用于第二次PCR扩增得到的产量表明，直取法回收的DNA经PCR反应扩增出有效目标片段大小的产物量平均约为30 ng/μL。而改良煮沸法回收DNA为模板的PCR反应扩增出有效目标片段大小的产物平均量与经典煮沸法的量相当，约是直取法的4倍，均在120 ng/μL左右（图3）。产物经与克隆载体连接、转化，蓝白斑筛选等操作，阳性克隆的测序结果显示插入片段单一。因此可用于后续的研究，这也验证了本实验方法是可行的。

图3 不同方法回收DNA的PCR扩增产物检测

3 讨论

目标DNA片段的回收和纯化是进行下游分子生物学的基础步骤。近年来已有不少报道关于DNA回收与纯化的方法，但大都局限用于琼脂糖凝胶［17，18］而从非变性PAGE胶中回收和纯化DNA的报道较少［19］。由于琼脂糖凝胶的分辨率较低，所以具有高分辨率的聚丙烯凝胶电泳（PAGE）在回收小片段等多种基因工程操作中作用尤其重要。目前较常用是煮沸法和沉淀法，但由于聚丙烯酰胺凝胶具有在高温下不熔，强韧致密的结构，煮沸、挤压、捣碎、浸泡的处理都不甚理想的特点，这些限制了DNA 的释放，从而影响回收的效率［20］。目前报道的几种方法，不是回收率低，就是操作繁琐，价格昂贵［21］。因此，完善而高效的回收方案亟待探索。本试验在现有研究的基础上采用直取法、煮沸法和改良煮沸法回收DNA小片段，均得到了目的条带，但改良方法获得的目的条带的浓度较直取法更大，效率高，这也验证了本试验借助液氮对聚丙烯酰胺凝胶的固化作用后研磨凝胶，破坏凝胶的结构使得DNA最大限度的从凝胶中释放出来，经煮沸后不用乙醇沉淀，选用常温浓缩减少目的产物的损失，从而提高了DNA 的回收率。试验结果也表明，本研究改良的方法是一种简单经济、回收率高的方法能被广大实验室研究人员所接受。

4 结论

经过比较不同方法，本研究运用液氮研磨使凝胶固化粉末，煮沸及常温浓缩处理，使凝胶中小片段DNA最大限度的释放，得到了高浓度，纯度较好的目的的片段。

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（责任编辑 狄艳红）

A Method of Recovering Short DNA Fragments from Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Xiang Xiaohua1，2Jiao Yushun1，2Wu Xinru1Cheng Yazeng1，2Hou Shuo1，3Liu Guanshan1Wang Yuanying1
（1. Tobacco Research Institute of CAAS，Key Laboratory of Tobacco Genetic Improvement and Biotechnology，CAAS，Qingdao266101；2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100081；3. College of Agriculture and Plant Protection，Qingdao Agricultural University，Qingdao266109）

The polyacrylamide gel electrophoresis with high resolution is a top choice for isolating and purifying specific short DNA fragments， and also serves as a prerequisite for a variety of subsequent molecular biology experiments. In this study， three methods， i.e.，modified boiling method（grinding with liquid nitrogen + boiling + concentrating at low temperature）， traditional boiling method（in which DNA is precipitated with absolute ethanol and 3 mol/L sodium acetate together）， and direct recovery method were used to extract short DNA fragments. The short DNA fragments were used as the template for a second PCR reaction. The results showed that recovered DNA fragments by the modified boiling method had higher purity and finer specificity， and the recovery rate was nearly the same as the traditional boiling method. Replacing the method of precipitation with ethanol and sodium acetate by method of concentrating at low temperature is feasible and novel.

non-denaturing polyacrylamide gel；short DNA fragments；secondary PCR；modified boiling method；gel recovery

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.011

2014-08-27

公益行行业专项（201203091），国家烟草专卖局重点项目（110201002002）

向小华，男，博士研究生，研究方向：烟草分子育种；E-mail：xiangxiaohuacaas@163.com

王元英，男，研究员，博士生导师，研究方向：烟草遗传育种；E-mail：wyytob@126.com