高粱SbGABA-Ts基因的克隆、原核表达及纯化

杨泽伟王龙海朱莉汪海黄大昉郎志宏

（1.西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳　621010；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京　100081）

高粱SbGABA-Ts基因的克隆、原核表达及纯化

杨泽伟1，2王龙海1，2朱莉2汪海2黄大昉2郎志宏2

（1.西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳621010；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京100081）

植物中GABA（γ-氨基丁酸）代谢与植物生长发育、信号传递及逆境响应等过程密切相关，而参与GABA代谢的关键酶GABA-T（γ-氨基丁酸转氨酶）在重要农艺作物中的研究相对滞后。利用同源性分析在高粱基因组数据库中获得两个γ-氨基丁酸转氨酶（SbGABA-T）基因，RT-PCR方法进行基因克隆，并连入原核表达载体pET28a（+），转化E. coli BL21（DE3）进行基因异源表达分析。结果表明，包含SbGABA-T编码区全长的融合蛋白主要在包涵体中表达，而去除了SbGABA-T N端信号肽的融合蛋白以部分可溶的形式存在。进一步优化表达条件，IPTG浓度为1 mmol/L时，16℃低温诱导18 h，即可获得大量可溶性融合蛋白。用带His标签的镍柱对融合蛋白进行了纯化。

高粱GABA-T；原核表达；纯化；信号肽

作为粮饲能兼用的作物，高粱［Sorghum bicolor（L.）Moench］对全球农业生态系统的贡献日益显现［1］。按年产量计算，高粱是世界上第五大重要的谷类作物，仅次于玉米、小麦、水稻和大麦（http：// www.fao.org）。更值得注意的是，高粱具有其他作物无法比拟的多重抗逆性，在雨水稀少的美国南部平原和非洲东北部，以及中国东北和新疆广阔的干旱

盐碱地都有广泛的种植。目前，已完成对美国优良高粱自交系BTx623的测序［2］。高粱基因组的高密度遗传图谱、表达图谱及基因功能鉴定等研究［3］，为玉米、小麦、大麦等禾谷类作物基因组研究提供极有价值的信息，是禾谷类作物的一个模式基因组。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种四碳非蛋白质氨基酸，广泛存在于动植物和各种微生物体内，其合成与代谢通过TCA循环的一个旁路，即GABA旁路进行［4］。研究表明，GABA旁路途径能通过调节胞质pH、碳氮代谢、蛋白质降解、激素合成、活性氧形成、多胺代谢、信号传递等重要生理过程，继而影响植物的生长发育、形态建成及胁迫应答［5-7］。

γ-氨基丁酸转氨酶（GABA-T）是GABA分解代谢中的第一步关键酶。较之哺乳动物和微生物，植物中GABA-T基因的研究相对滞后。最近几年，相继从拟南芥、番茄、水稻中克隆到GABA-T基因，这些研究表明，GABA-T基因在亚型数量、亚细胞定位、组织发育丰度等各方面，随植物种类的变化而表现出较大的差异，对胁迫的响应也不尽相同［8-10］。干扰GABA-T基因的表达，拟南芥gaba-t/pop2突变体花粉管发育异常、种子产量降低，对盐胁迫的耐受力下降［11］；番茄（Solanum lycopersicum L.）SlGABA-TRNAi转基因植株后代出现严重的矮化和不育［12］；利用GABA-T专一性抑制剂vinyl-GABA（VGB）处理甘蓝幼苗，其主根长度减少了约44%［13］，这表明GABA-T对于保障GABA的正常代谢，从而维持植株正常的生长发育和胁迫应答至关重要。

目前为止，有关GABA积累的确切生理学意义，及GABA旁路与其他生理进程间相互作用的分子机制仍不清楚，需要对GABA旁路途径中关键基因及关键环节作进一步解析。相关的报道也多集中在拟南芥和烟草等模式植物中，在重要农作物尤其是高粱中的研究还属空白，关键的基因尚未得到克隆和鉴定，更不清楚GABA途径是否在高粱多重抗逆性中扮演关键角色。本研究通过序列相似性比对和RT-PCR方法，首次从高粱基因组中克隆得到两个候选SbGABA-T基因，将其在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达，并利用镍柱对融合蛋白进行纯化，旨为高粱SbGABA-T蛋白的底物活性、催化机制的研究，以及进一步相关抗体的制备及免疫学方法的考察等奠定基础，也为其他禾谷类作物相关基因的研究提供借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 高粱［Sorghum bicolor（L.）Moench］自交系BTx623，由中国科学院植物所景海春课题组馈赠。

1.1.2 表达菌株及质粒载体 本研究所用菌株E. coli DH5α、BL21（DE3）pLysS、克隆载体T-easy blunt购于北京全式金生物技术有限公司。表达载体pET28a（+）购于Novagen公司。

1.1.3 工具酶及生化试剂 RNA提取所用的Trizol试剂购于Invitrogen公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Phusion高保真酶等购自NEB公司；反转录试剂盒为Fermentas公司产品；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA Marker（DL5000）、Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒等均购自北京康为世纪生物科技有限公司；IPTG及其他生化试剂等购自于Sigma公司；引物合成及测序由北京中美泰和公司完成。

1.2 方法

1.2.1 SbGABA-T基因的cDNA扩增 以拟南芥（Arabidopsis）的GABA-T基因序列（GenBank Accession No.At3g22200）［14］在高粱全基因组数据库（NC_01-2876）中进行比对，选取序列同源性较高的基因，在线分析程序NEW PLACE（https：//sogo.d n a.affrc. go.jp/）、TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/serv ices/ TargetP/）、PSORT（http：//psort.hgc.jp/ form.ht m l）分析其信号肽序列［15］。利用Primer Premier 5.0软件分别设计开放阅读框（ORF）全长引物（SbGABA-T表示）及去除N端信号肽后剩余区域（SbGABA-ΔT表示）的引物（下划线为限制酶酶切位点）：

利用Trizol试剂提取高粱BTx623幼苗总RNA，并反转录生成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。扩增条件为：98℃预变性30 s；98℃ 变性 10 s，58℃退火20 s；72℃延伸1 min，循环33次；72℃延伸5 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收所需大小的条带，连接至克隆载体T-easy blunt，并转化到大肠杆菌DH5α中，选取阳性转化子送公司测序。

1.2.2 原核表达载体的构建 提取阳性转化子质粒，BamH I和Sac I双酶切处理，所得片段连入相同酶切的pET28a（+）质粒，并转化到大肠杆菌DH5α中，涂布含卡那霉素（终浓度为50 mg/L）的LB平板。选取PCR阳性的克隆提取质粒进行酶切验证，同时送公司测序。鉴定正确的转化子提取质粒，转化到表达菌株BL21（DE3）pLysS中。

1.2.3 重组质粒的诱导表达 挑取BL21（DE3）pLysS阳性单菌落，接种至含卡那霉素（终浓度为50 mg/L）的液体LB培养基中，37℃，200 r/min培养过夜，所得培养物按1%接种至新鲜培养基；37℃、200 r/min培养至OD600约0.6，加入IPTG溶液，16℃、200 r/min进行诱导表达［16，17］。设定IPTG诱导浓度梯度（终浓度）：0、0.25、0.5、1.0 mmol/L；及诱导时长梯度：10、14、18、22、34 h。分别取样进行SDS-PAGE分析，以确定合适的诱导表达条件。

按确定的优化条件进行诱导表达，离心收集菌体，用PBS溶液（140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，2 mmol/L PMSF，1% Triton-X-100）重悬，超声波间歇处理破碎菌体。离心后，菌液上清与沉淀分别取样进行SDS-PAGE电泳检测。

1.2.4 融合蛋白的纯化 按Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒说明书填充好镍柱，平衡柱子后负载上样（菌液上清），收集流穿液；依次用不同梯度的咪唑缓冲液进行目的蛋白的洗涤和洗脱，分别收集洗涤液和洗脱液。缓冲液成分为：20 mmol/L Tris-HCl（pH7.9），0.5 mol/L NaCl，10 -500 mmol/L咪唑。收集的液体分别取样进行SDS-PAGE电泳检测。

2 结果

2.1 高粱SbGABA-T基因的cDNA克隆

根据已知的拟南芥AtGABA-T基因（GenBank Accession No.At3g22200）序列，在高粱基因组中数据库（NC_012876）中进行Blast，获得两个候选GABA-T基因亚型（hypothetical protein，未注释），本研究将其分别命名为SbGABA-T1（GenBank Accession No.XM_002445162）、SbGABA-T2（GenBank Accession No.XM_002 447046），其中，SbGABA-T1位于高粱基因组第7号染色体上，编码509个氨基酸；SbGABA-T2则位于高粱基因组第6号染色体上，编码511个氨基酸。SbGABA-T1、SbGABA-T2与拟南芥AtGABA-T的氨基酸序列相似性分别为73.11%和72.51%，两亚型间的相似性为78.78%，且可变区域多集中在序列N端。进一步分析可知，其前端信号肽剪接位点分别在第30和第31位氨基酸位置。据此设计引物，以高粱BTx623品种cDNA为模板，分别克隆基因全长序列及截去N端信号肽后剩余部分序列，如图1琼脂糖凝胶电泳所示，基因全长大小约为1 500 bp，截去N端信号肽后大小约为1 400 bp，与预期的片段大小相符。将PCR产物连入克隆载体并测序，测序结果与公开数据库中的相关序列一致，表明高粱BTx623基因组中确实存在SbGABA-T1、SbGABA-T2两个转录本。保守功能域分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）表明，SbGABA-T1、SbGABA-T2均隶属于乙酰鸟氨酸转氨酶（AAT _Ⅰ）超家族，而γ-氨基丁酸转氨酶是该家族成员之一。

图1 RT-PCR克隆高粱SbGABA-T基因

2.2 重组质粒pET28a（+）-SbGABA-Ts的构建

分别将SbGABA-T1、SbGABA-T2、SbGABA-ΔT1、SbGABA-ΔT2四个片段构建到带有His标签的原核表达载体pET28a（+）上（图2-A）。相应的重组质粒pET28a（+）-SbGABA-Ts经过BamHⅠ和SacⅠ双酶切鉴定，结果如图2-B所示，酶切后表达载体大小约为5 300 bp，目的片段大小约为1 500 bp和1 400 bp，符合预期。进一步测序结果表明目的基因均位于正确的读码框中，表明重组质粒pET28a（+）-SbGABA-Ts构建正确。

图2 重组质粒pET28a（+）-GABA-Ts的构建

2.3 重组蛋白pET28a（+）-SbGABA-Ts诱导表达

条件

将构建正确的重组表达载体利用热激法转入表达菌株E. coli BL21（DE3）pLysS后，进行融合蛋白的诱导表达。实验中发现，无论如何优化诱导表达条件，如IPTG浓度、诱导时长等，SbGABA-Ts全长融合的目的蛋白表达量均非常少，且多集中在包涵体中，无法满足下一步研究需要；而截去N端信号肽后的SbGABA-△T的融合蛋白，成功实现在可溶性组分中高效表达（图3）。较之未加IPTG的对照组，加有IPTG诱导的实验组在55 kD附近新增了一条蛋白条带（图3箭头指示），与预期融合蛋白的分子量相符。

图3 重组蛋白pET28a（+）-SbGABA-T1/△T1的诱导表达

进一步优化表达条件，以转化pET28a（+）-SbGABA-T1重组质粒的菌株进行IPTG诱导浓度和诱导时长的探索，结果如图4所示。加有IPTG的实验组均成功实现重组蛋白的表达，尽管融合蛋白在包涵体中分布较多，但菌体破碎上清中仍有明显目的蛋白的产生（图4-A）。不同浓度IPTG作用下，融合蛋白表达量的差别并不明显，表明融合蛋白的表达量受IPTG诱导浓度的影响有限。相对来说，1 mmol/L IPTG诱导下的目的蛋白表达量在可溶性组分中分布最多，相应地在包涵体中分布较少，表明1 mmol/L IPTG可以作为比较合适的诱导浓度。图4-B表明，pET28a（+）-SbGABA-△T1重组蛋白表达量随诱导时间的延长而增加，但增加幅度有限，考虑到诱导时间过长可能影响融合蛋白的结构功能，选择表达量相对较高的18 h作为最适的诱导时长。

2.4 重组蛋白pET28a（+）-SbGABA-△T的纯化

根据优化的诱导表达条件对重组菌BL21（DE3）/ pET28a（+）-SbGABA-△T1/△T2进行融合蛋白的大量诱导表达，并利用带His标签的镍柱进行目的蛋白的纯化。如图5-A、B所示，流穿液中目的蛋白的量明显减少，表明目的蛋白已结合到镍柱上，经过梯度浓度的咪唑缓冲液洗涤后，杂蛋白被除去，最终目的蛋白在咪唑浓度为250 mmol/L时被洗脱下来，相应的SDS-PAGE图表明，纯化的目的蛋白条带单一，且浓度较高，能够满足进一步实验的需要。

图4 不同IPTG浓度及不同诱导时间下重组蛋白pET28a（+）-SbGABA-△T1的表达

图5 重组蛋白pET28a（+）-SbGABA-△T1/△T2的纯化

3 讨论

植物受各种逆境胁迫而快速积累GABA的现象已广为人知［4-6］，近年的研究进一步表明，GABA途径在植物胞质pH调节、碳/氮源平衡、环境胁迫应答、植株生长发育及形态建成等方面都发挥着重要的作用［5-7］。作为GABA分解代谢的关键基因，GABA-T对于维持GABA途径的正常运转具有重要意义，而植物中相关的研究一直比较滞后。近年来，随着拟南芥、水稻、番茄等作物中GABA-T基因相继被克隆，GABA-T在植物生长发育和胁迫应答中的作用才日益清晰［8-10］。本研究首次对高粱SbGABA-Ts基因进行了分离及原核表达分析。研究发现，不同于拟南芥中GABA-T基因的单拷贝，高粱中存在两个GABA-T基因亚型，与番茄（Solanum lycopersicum L.）中相关基因亚型数量一致。GABA-T基因以基因家族形式存在，一定程度上有助于植物在干热环境下光呼吸作用积累的乙醛酸的代谢，是植物适应环境压力的表现［8］。

多序列比对和保守结构域分析表明，高粱SbGABA-T基因与已知的植物GABA-T基因的氨基酸序列相似性达到71%-88%，而且均隶属于乙酰鸟氨酸转氨酶（AAT_Ⅰ）超家族。但以往的研究证实，植物中GABA-T基因各亚型间的时空表达模式、亚细胞定位、蛋白酶活性等不尽相同，预示着植物中GABA-T基因各亚型间生理功能上的差异［8-10］。这种结构与功能上的保守性和差异性，确保了GABA-T基因各亚型间在各种生理过程中既能“相互协作”，又能“各司其职”，体现了植物相关代谢调控的灵活和巧妙［18］。

GABA-T酶活的考察是GABA-T基因原核表达后重要的研究内容之一。植物中GABA-T蛋白酶底物特异性的研究仍存在争议。早期研究发现，哺乳动物、真菌、原核生物中的GABA-T多以α-酮戊二酸作为氨基受体［13］，而植物体内GABA-T则表现出丙酮酸和α-酮戊二酸两种活性［19］。但植物体内酶活的研究不可避免的受到诸多因素的影响，如目标蛋白酶提取效率低、分离困难、其他蛋白酶的干扰等［20］。对目的蛋白进行异源表达是研究蛋白结构和功能的有效手段。近期，Clark等［8］通过对拟南芥GABA-T体外重组表达分析发现，拟南芥中GABA-T主要以丙酮酸和乙醛酸为氨基酸受体，而非α-酮戊二酸，类似的结果也相继出现在番茄、水稻GABA-T的研究中［8-10］。植物中GABA-T酶具有乙醛酸底物活性的发现，进一步开拓了人们关于GABA途径的传统认知。乙醛酸作为植物光呼吸途径的主要产物，表明GABA途径可能与植物光呼吸途径联系［21］，由此推测，GABA-T能直接利用异柠檬酸降解而来的乙醛酸形成甘氨酸和第二个琥珀酸分子（GABA旁路中琥珀酸脱氢酶作用形成一分子琥珀酸），补充至TCA循环中，这有助于维持受胁迫植物在碳源不足的状态下的能量供应［22］。

本研究通过序列相似性比对和RT-PCR方法成功克隆到高粱两个GABA-T基因，并利用pET28a（+）原核表达系统进行基因的异源表达分析，最终获得了大量高质量纯化的重组蛋白，蛋白浓度分别达到965.46 ng/μL和893.09 ng/μL。值得注意的是，GABA-T基因编码区全长融合的目的蛋白与去除了N端信号肽的目的蛋白在原核表达系统中的差异非常显著，前者存在于包涵体中，且表达量有限；而后者虽然在包涵体中也有大量分布，但在可溶性组分中也有明显的表达。一种解释是原核细胞中缺乏相关的机制对诱导的蛋白质前体进行进一步加工，而去除了N端信号肽的GABA-△T是一种更接近于植物体内成熟的GABA-T的存在形式，这对于目的蛋白在原核表达系统中表达量和可溶性的提高更为有益［8］。重组蛋白以可溶性形式存在，使后续的蛋白纯化过程可以在无变性剂的相对温和条件下进行，纯化后的蛋白可以最大限度地保持其空间构象与功能，这为今后高粱GABA-T酶活的分析、相应抗体的制备及通过免疫学方法的深入研究奠定了基础，也为其他禾谷类作物相关基因的研究提供了参考和借鉴。

4 结论

通过序列相似性比对和RT-PCR方法首次克隆得到高粱两个GABA-T基因，保守结构域分析表明该基因均隶属于乙酰鸟氨酸转氨酶（AAT _Ⅰ）超家族。利用pET28a（+）原核表达系统进行基因的异源表达，表明SbGABA-T编码区全长的融合蛋白主要在包涵体中表达，而去除了其N端信号肽的融合蛋白以部分可溶的形式存在，且在1 mmol/L IPTG（终浓度）、16℃诱导条件下高效表达。经Ni亲和层析柱纯化，250 mmol/L咪唑溶液洗脱，即可得到纯化的融合蛋白。

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（责任编辑 李楠）

Cloning，Prokaryotic Expression of Sorghum bicolor SbGABA-Ts

Yang Zewei1，2Wang Longhai1，2Zhu Li2Wang Hai2Huang Dafang2Lang Zhihong2
（1. Southwest University of Science and Technology，School of Life Science and Engineering，Mianyang621010；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100081）

GABA is a ubiquitous four-carbon，non-protein amino acid，and has been associated with growth and development，signaling transduction，and stress response in plants. GABA transaminase（GABA-T），the enzyme responsible for the catabolism of GABA，has not been fully explored，especially in several important crops. Two putative GABA transaminase genes（GABA-T）from Sorghum bicolor were obtained based on homology analysis with the identified GABA-Ts of other plants and RT-PCR. Subsequently，the two SbGABA-T genes and corresponding N-terminal truncated SbGABA-Ts were inserted into pET28a（+）vector and individually imported into E. coli strain BL21（pLysS，DE3）. Percentage improvement of soluble recombinant proteins were showed when removing the targeting peptide sequence of SbGABA-Ts. The fusion proteins were expressed partially in soluble form after incubating for 18 h at 16℃ by adding 1 mmol/L IPTG，and purified through nickel-affinity chromatography column.

Sorghum bicolor GABA-T；prokaryotic expression；purification；signal peptide

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.015

2015-01-29

国家自然科学基金项目（31271790，31471558）

杨泽伟，男，硕士研究生，研究方向：植物抗逆机理；E-mail：yangzewei555@sina.com

朱莉，女，副研究员，硕士生导师，研究方向：植物抗逆分子生物学；E-mail：zhuli01@caas.cn