香樟Actin基因的克隆及表达分析

李勇鹏 张力维 姚瑶 黄蕊 杜丽

（南阳师范学院生命科学与技术学院，南阳　473000）

香樟Actin基因的克隆及表达分析

李勇鹏 张力维 姚瑶 黄蕊 杜丽

（南阳师范学院生命科学与技术学院，南阳473000）

Actin作为一个看家基因，经常在实时定量PCR中被用作内参对不同样品中的mRNA进行定量，因此在基因表达分析中扮演重要的角色。利用同源克隆的方法，根据GenBank中已经公布的其他植物的Actin基因的保守序列设计简并引物，采用RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）技术从香樟中获得了4个cDNA片段。分子生物学分析软件分析结果显示，4个片段大小为均为998 bp，编码332个氨基酸；同源性分析表明，所获得的片段属于Actin亚家族，分别命名为CcACTa、CcACTb、CcACTc 和CcACTd并提交GenBank（登录号：KM086736、KM086737、KM086738和KM086739）。实时定量PCR结果显示，CcACTc在根、茎、叶及低温处理的叶片中表达量相对稳定，可以作为候选内参基因。

香樟；Actin；基因克隆；表达分析；实时定量PCR

半定量PCR（Semi-quantitative RT-PCR）和实时定量PCR（quantitative real-time PCR）即Q-PCR是对来自不同组织的mRNA进行定量的有效方法，内参基因可以矫正样品之间的差异，因此对于上述两种分析方法选择合适的内参基因是非常必要的［1］。在植物基因的表达分析研究中比较常用的内参基因是看家基因（house-keeping gene），因为看家基因的表达水平受环境影响较小，主要包括肌动蛋白基因（ACT）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（G3PDH/ GAPDH）、18S 和 28S 核糖体RNA 基因（18S rRNA、28S rRNA）及肽链伸因子（EF1a）基因等［2］。其中Actin是一个比较常用的内参基因，该基因在真核细胞中普遍存在，并且编码一类高度保守的蛋白，所编码蛋白是细胞骨架的基本组成成分之一，参与许多重要的亚细胞进程，诸如细胞分裂与伸长、胞吞作用、细胞信号转导、重力感应、极性生长、细胞器运动和程序性细胞死亡等，因此在植物发育和形态发生中发挥重要作用［3-6］。在肌动蛋白结合蛋白（Actin-binding protein）的作用下，肌动蛋白微丝的长度、极性、稳定性和三维结构不断变化［7，8］。自从1963年，Yan和Shi 第一次证明高等植物中存在肌动蛋白Actin，研究者们已经相继从多种高等植物中获得Actin基因，如玉兰、枣树、木薯、芍药、豌豆和荔波连蕊茶等［9-15］。然而，还有许多物种的Actin基因有待分离和鉴定，以便作为内参对该物种其它基因进行定量分析。

香樟（Cinnamomum camphora），又名樟树、乌樟，樟科（Lauraceae）樟属（Cinnamomum），属常绿乔木，含有特殊香气和挥发油，是贵重家具、高级建筑、造船和雕刻等的理想用材。近年来，香樟在园林绿化中的应用越来越多，正成为城市中重要的园林绿化树种［16］。香樟主要分布于长江以南及西南地区，近几年黄河流域也有分布。低温胁迫是限制香樟的地理分布及其在园林绿化中应用的一个重要环境因子。因此，培育香樟抗寒新品种有利于其在冬季寒冷的北方地区推广。研究抗寒相关基因，从而利用基因工程技术获得香樟抗寒新品种，具有目的性强、方便快捷等优点，是香樟新品种改良的有效途径。香樟抗寒相关基因的表达模式研究需要一个在低温条件下表达量相对恒定的内参，进行实时荧光定量PCR分析。Actin基因被证明在一些逆境胁迫条件下表达量相对恒定［17］，也经常作为内参应用于植物抗寒相关基因DREB家族基因的表达分析。如Peng等［18］在研究羊草DREB基因转拟南芥的表达分析时以拟南芥Actin作为内参；张勇等［19］在研究草莓FaCBF1基因的表达分析时也运用了Actin基因作为内参。本实验室已经从香樟中分离到两个DREB1/CBF基因（数据未公布），优先选择Actin基因作为内参，然而，迄今为止关于香樟Actin基因的研究还未见报道。本研究首次从香樟中克隆Actin基因片段，并用Q-PCR技术对CcACTc基因进行表达分析，研究其在香樟不同器官中以及低温处理条件下的稳定性，旨在为开展香樟优良内参基因的筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 试验材料为本实验室保存的香樟无性系组培苗，继代培养基为MS+2.0 mg/L BA+0.5 mg/L 2，4-D，生根培养基为MS基本培养基，其中蔗糖30 g/L，琼脂粉8.0 g/L，培养温度（25±1）℃，光照强度2 500 lx，光照时间16 h/d。待材料在MS基本培养基上生长至有5-7片叶片时，开始对材料进行低温处理，处理温度为4℃，分别于0、0.5、1、2、4、6、12、24、48和72 h 随机取叶片；同时选取生根良好且长势一致的健壮组培苗，取其根、茎、叶片。所有的材料平行取4个重复，收获后立即用液氮速冻，-80℃保存直至RNA提取。

1.1.2 主要试剂与仪器 大肠杆菌感受态Trans5α、EasyTaq DNA聚合酶、TransTaq-T DNA聚合酶购自北京全式金（Transgen）生物技术有限公司；Premix ExTaq DNA聚 合 酶、primeSTAR GXL DNA聚 合酶、dNTP Mixture、pMD19-T Vector、DL2000 DNA Marker、PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit购自大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司；CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒、EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒购自北京艾德莱（Aidlab）生物科技有限公司；0.2 mL EU材质薄壁8连管购自荷兰Bioplastics公司；RT-qPCR反应试剂为FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）购自瑞士罗氏（Roche）公司；其他生化试剂采用国产或者进口分析纯。荧光定量PCR仪为美国伯乐（Bio-Rad）公司生产的CFX-96实时荧光定量系统。

1.1.3 引物设计 通过比对GenBank中已公布的其他植物Actin基因cDNA序列，根据保守区域利用Primer5.0软件设计一对简并引物CcAct-F和CcAct-R，预测所得片段长度约1 000 bp；根据CcACTc基因核苷酸序列的特异区域设计一对Q-PCR引物CcAct-RTF和CcAct-RTR，扩增片段373 bp。实验所用引物信息，见表1。

表1 使用到的引物信息

1.2 方法

1.2.1 Actin基因片段的克隆 利用北京艾德莱EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒提取香樟叶片总RNA，取2 μg RNA利用TaKaRa公司PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Ki反转录合成第一链cDNA，作为PCR扩增香樟Actin基因片段的模板。

PCR反应体系（20 μL）：ddH2O 7 μL，Premix ExTaq 10 μL，CcAct-F和CcAct-R（10 μmol/L）各1 μL，cDNA模板1 μL。PCR扩增条件：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，28个循环；72℃总延伸10 min。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

经电泳检测PCR扩增产物与预期目的条带片段大小符合，另做5管20 μL体系，利用艾德莱琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带。回收产物连接于克隆载体 pMD19-T上，16℃过夜，转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞，以通用引物M13进行菌落PCR，挑取阳性菌扩大培养送往上海生工测序。

1.2.2 Actin基因的生物信息学分析 将测序获得的香樟Actin基因片段的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列，在NCBI网站上使用BLAST在线分析工具进行序列相似性分析。序列的比对、翻译利用DNAMAN分析，系统进化树先用ClustalX进行多序列比对，然后利用Bioedit将多序列比对结果剪切对齐后用MEGA进行系统进化树的构建。

1.2.3 CcACTc基因在香樟不同器官及低温处理下叶片中的表达分析 采用实时定量PCR的方法检测正常生长条件下的香樟组培苗不同器官及低温处理0-72 h条件下叶片中Actin基因的表达差异。分别提取香樟根、茎、叶片及经低温处理不同时间的叶片的总RNA，反转录成cDNA，RNA起始模板量为2 μg，将反转录产物稀释10倍，作为Q-PCR反应模板，定量分析引物CcAct-RTF和CcAct-RTR的扩增产物先进行电泳检测及测序，确保其扩增产物特异。Q-PCR反应采用SYBR Green I法，利用罗氏公司的FastStart Universal SYBR Green Master（Roche），在伯乐（Bio-Rad）CFX96 实时定量PCR仪上进行。反 应 体 系（10 μL）：ddH2O 3.4 μL，2×Power Taq PCR MasterMix 5 μL，CcAct-RTF和 CcAct-RTR（10 μmol/L）各0.3 μL，cDNA 1 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40次循环；熔解曲线在65-95℃之间，每0.05 s升高0.5℃。基因表达分析软件为Bio-Rad CFX manager 2.0，每一样品重复3次，实验重复3次，根据各个样品的CT值，利用Excell 2007和BestKeeper进行数据分析，BestKeeper是基于各个样品的CT值计算标准偏差SD，SD值越小，基因稳定性越好，若SD＞1，则认为该基因不稳定［20，21］。

2 结果

2.1 总RNA的提取及检测

提取香樟叶片总RNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图1-A）显示，28S和18S条带清晰，表明本实验提取的RNA完整性良好，可以用于后续反转录工作。

2.2 PCR扩增产物的鉴定

以香樟cDNA为PCR反应模板，以CcAct-F、CcAct-R为引物进行PCR扩增。反应产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，在1 000 bp附近有一条亮带（图1-B），与预期片段大小一致，可能是香樟Actin基因片段，进一步测序鉴定。

2.3 阳性克隆的鉴定

将回收纯化的目的片段连接到克隆载体pMD19-T上，转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞，随机挑选15株抗性菌进行PCR检测，琼脂糖凝胶电泳结果（图2）显示，阳性菌落PCR扩增产物比目的基因片段PCR产物稍大，挑取保存在平板上的相应阳性菌扩大培养，并测序。

图1 香樟叶片总RNA（A）和香樟ACT基因PCR（B）扩增结果

图2 菌落PCR筛选阳性重组子结果

2.4 测序结果及多序列比对

测序结果经分析并去除两端引物序列，获得了4个大小均为998 bp的高度相似的cDNA序列片段，均编码332个氨基酸（从第3个碱基开始翻译），利用DNAMAN将所获得的4条核苷酸序列进行多序列比对，一致性为92.23%（图3），图中可以看出突变位点大多在密码子的第3个碱基位点；而推导的相应氨基酸序列一致性高达99.62%（图4），结果显示，其氨基酸序列相互之间有1-4个氨基酸的差异。将本研究获得的4个片段的核苷酸序列及推导的氨基酸序列在NCBI中进行BLASTN/P分析，结果显示所获得序列属于Acitin基因家族，分别命名为CcACTa、CcACTb、CcACTc 和CcACTd。其中，CcACTa和CcACTb的核苷酸序列都与樟科植物鳄梨Actin基因（GU272027.1）相似度最高，分别达91%和94%；而氨基酸序列分别与无油樟科植物无油樟一种未知蛋白（XP_006854536.1）和樟科植物鳄梨Actin（ADA70361.1）的相似度最高，均达到100%。CcACTc的核苷酸序列与樟科植物山鸡椒ACT7（KF706373.1）相似度最高，达98%，氨基酸序列与樟科植物山鸡椒ACT7（AGZ90151.1）相似度最高，达100%；CcACTd的核苷酸序列与葡萄科植物葡萄的ACT1（XM_002282480.2）的相似度最高，达87%，氨基酸序列与无油樟科植物无油樟未知蛋白（XP_006846523.1）相似度最高，达99%。由此推断，本研究所获得的基因片段应该为香樟肌动蛋白Actin基因片段，提交GenBank，登录号分别为KM086736、KM086737、KM086738和KM086739。

2.5 香樟Actin基因的系统进化树的构建

从NCBI下载与香樟肌动蛋白（CcACT）同源性较高的21个物种的Actin基因的氨基酸序列，利用ClustalX软件进行多序列比对，比对结果经对齐后利用MEGA软件建立系统进化树，结果（图5）表明，CcACTc与山鸡椒ACT7、CcACTa与无油樟未知蛋白、CcACTb和CcACTd与鳄梨ACT分别聚为一支，表明它们在氨基酸水平上亲缘关系较近。

2.6 CcACTc基因在香樟不同器官及低温处理下叶

片中的表达分析

利用CcAct-RTF和CcAct-RTR引物进行普通PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增产物没有引物二聚体和非特异条带，经测序表明该对引物能特异地扩增相应目的片段，可以用于Q-PCR分析。通过Q-PCR技术，检测香樟CcACTc基因在不同器官及低温处理下叶片中的表达情况，根据各个样品的平均CT值，利用Excel 2007作图。Q-PCR结果显示，CcACTc基因在香樟组培苗的根、茎、叶部位中（图6-A）的平均CT值差异不大；低温处理0-72 h各个叶片样品的平均CT值（图6-B）虽然有一定波动，但也相对稳定。

BestKeeper根据各个样品的CT值计算标准偏差SD，CcACTc基因在不同器官中和低温胁迫处理的叶片中SD值分别为0.38和0.29。

3 讨论

图3 新克隆的4条CcACT核苷酸序列片段的多序列比对

图4 所获得的4条cDNA序列推导氨基酸的多序列比对

图5 香樟CcACT基因推导的氨基酸序列与其他植物Actin氨基酸序列的系统进化树

Actin是一种起源较早的基因，植物与哺乳动物之间有大约90%的相似性［22］，由于表达量高且相对稳定，一般作为该物种其它基因定量和半定量PCR分析的内参基因，在大多数植物的表达分析研究中，Actin基因家族是使用次数最多的看家基因，并且广泛应用于DREB家族基因表达分析研究［12-23］。高等植物肌动蛋白基因属于多基因家族［24］，目前为止，研究者们已经从多种物种中克隆到了Actin基因。本研究首次从园林植物香樟中分离到了Actin基因片段的cDNA序列，在实验中用一对引物，以香樟叶片cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经测序并分析获得了4条高度相似却有一定差异的cDNA序列片段，起初认为可能是由于引物的非特异性所致或者是 DNA聚合酶引起错配或测序导致的错误，我们又重新进行了反转录并利用3种不同的DNA聚合酶（EasyTaq、TransTaq-T DNA聚合酶和primeSTAR GXL DNA聚合酶）以相同的程序进行香樟Actin基因片段的克隆，结果除primeSTAR GXL DNA聚合酶未能扩增出条带，其余两种DNA聚合酶均能扩增出正常条带。将这两种酶的PCR扩增产物连接到T载体转化大肠杆菌感受态并分别随机挑选20株阳性菌进行测序，结果依旧可以获得4条不同的cDNA序列片段。本试验表明，香樟叶片确实存在4个不同的Actin基因，并且序列高度相似，它们在香樟中可能行使相似的功能。从4条cDNA序列片段的核苷酸序列比对结果来看，核苷酸序列之间存在一定的差异，一致性达92.23%，但是4条cDNA序列片段所推导的氨基酸序列之间一致性高达99.62%，相互之间仅有1-4个氨基酸的差异，可能是由于碱基的突变位点主要集中在密码子的第3个碱基位点所致。类似的是，李军等［25］在桑树中也一次获得了2个同源性较高的肌动蛋白基因MaACT1、MaACT2。

图6 香樟CcACTc基因在植株不同器官（A）及低温处理下（B）叶片中的平均CT值

本研究所获得的CcACTa、CcACTb、CcACTc 和CcACTd基因经NCBI在线分析均含有植物肌动蛋白家族的特征序列ATP、Gelsolin 和Profilin 结合位点，并且BLASTN/P分析结果显示，它们与其它植物的Actin基因的核苷酸序列以及相应氨基酸都有较高的同源性，证明本研究所获得的基因片段确实为香樟肌动蛋白基因（CcACT），也进一步证实了肌动蛋白的高度保守性［2627］。此外，从NCBI下载与香樟肌动蛋白（CcACT）同源性较高的21个物种的系统进化树分析显示，香樟肌动蛋白（CcACT）与山鸡椒、无油樟和鳄梨的肌动蛋白聚为一支，这与NCBI的BLASTP在线同源性分析结果一致，也支持了传统分类方法将香樟、山鸡椒和鳄梨分为同一樟科植物。还可以看出各个物种的Actin起源于同一祖先，拟南芥ACT2独立一支，而本研究克隆的香樟CcACT与拟南芥ACT7聚为一类，CcACT可能属于ACT7。各个物种之间Actin的氨基酸序列高度保守表明Actin在不同物种行使相近的功能，其在进化过程中之所以变化较小可能是为了维持其在植物发育和形态发生中行使的重要功能［15］。CT值作为评估内参基因稳定性的一个重要指标广泛应用于内参基因的筛选中，CT值是指反应体系累计足够的扩增产物，至可以产生可检测的荧光信号时的循环数，主要由扩增反应体系中模板的初始浓度决定。如果初始模板浓度低，需要较多的扩增循环才能产生足够的荧光信号；反之，只需要较少的扩增循环就可以累计足够的产物，从而产生高过背景的荧光信号，即基因表达量与该样品CT值呈反比例关系。基于Q-PCR的表达分析结果显示，CcACTc基因在不同植物器官组织及低温处理叶片中的CT值差异不大，并且，BestKeeper根据各个样品的CT值计算标准偏差SD值远小于1，综上可知，该基因在香樟根、茎、叶和低温处理条件下的叶片中表达量稳定，为一个非组织特异型表达，即组成型表达的肌动蛋白基因。期望可以作为香樟DREB1/CBF基因及其它功能基因研究的内参基因，也可以作为筛选香樟优良内参基因的候选基因。

4 结论

本研究所获得了香樟肌动蛋白基因（CcACT）且首次在香樟叶片组织中分离到氨基酸序列相似度较高的4个Actin基因，它们在香樟中可能行使相似的功能。CcACTc基因在香樟根、茎、叶和低温处理条件下表达量稳定，期望可以作为香樟DREB1/CBF基因及其它功能基因研究的内参基因，也可以作为筛选香樟优良内参基因的候选基因。

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（责任编辑 李楠）

Cloning and Expression Analysis of Actin Gene in Cinnamomum camphora

Li Yongpeng Zhang Liwei Yao Yao Huang Rui Du Li
（School of Life Science and Technology，Nangyang Normal University，Nanyang473000）

As a house-keeping gene， Actin has been always being used as an internal standard to normalize mRNA levels between different samples by quantitative real-time PCR， thus plays an important role in gene expression analysis. In this research， through a method of homology cloning， a pair of degenerate primers were designed based on the conserved sequences of Actin genes from other plants submitted to GenBank， and then 4 cDNA fragments from Cinnamomum camphora were obtained using RT-PCR. Molecular biological analysis showed that，each of the 4 cDNA fragments was 998 bp and encoded a putative protein of 332 amino acids. Moreover， according to the homology analysis，the 4 cDNA fragments belonged to Actin subfamily， and they were named CcACTa， CcACTb， CcACTc and CcACTd， and deposited in GenBank（Accession number：KM086736 KM086737 KM086738 and KM086739）. Quantitative real-time PCR results revealed that the expression level of CcACTc in different organs such as root， stem， leaf and leaves under low temperature treaments was relatively stable. It could serve as a candidate reference gene.

Cinnamomum camphora；Actin；gene cloing；expression analysis；quantitative real-time PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.019

2014-10-15

国家自然科学基金资助项目（31100511），河南省高校青年骨干教师计划资助项目（2010GGJS-161），南阳师范学院博士科研启动资助项目（nynu200746），2015年度研究生创新基金项目（2015CX008）

李勇鹏，男，硕士研究生，研究方向：园林植物遗传育种；E-mail：daniel_lee1217@yeah.net

杜丽，女，博士，副教授，研究方向：园林植物遗传育种；E-mail：dldldlucky@163.com