FX-139发酵液及菌丝体提取物对人参愈伤组织生长及防御酶系的影响

郭双双 史册 韩梅 杨利民

（吉林农业大学中药材学院　吉林农业大学省部共建生态恢复与生态系统管理国家重点实验室，长春　130118）

FX-139发酵液及菌丝体提取物对人参愈伤组织生长及防御酶系的影响

郭双双 史册 韩梅 杨利民

（吉林农业大学中药材学院吉林农业大学省部共建生态恢复与生态系统管理国家重点实验室，长春130118）

以人参栽培土壤中分离纯化的生防菌株放线菌FX-139的发酵液和菌丝体提取物为供体，研究了其对人参愈伤组织生长的影响，及诱导受体防御酶的能力。结果表明：（1）FX-139发酵液和菌丝体提取物浓度为20 mg/L的处理条件对人参愈伤组织生长促进作用最强，比对照增加了68.96%、51.60%，差异显著。（2）发酵液水饱和正丁醇提取物处理下PAL、POD、PPO酶活峰值分别出现在第21天、第14天、第28天，比CK依次提高了1.29倍、2.5倍、2.12倍。菌丝体丙酮提取物处理下PAL、POD、PPO酶活峰值分别出现在第21天、第14天、第14天，比CK依次提高了1.9倍、2.6倍、1.4倍。（3）通过对人参愈伤组织防御酶活性研究表明，发酵液和菌丝体提取物处理下PAL、POD、PPO酶活性均有明显变化。总体来说，放线菌FX-139发酵液和菌丝体提取物可以诱导人参愈伤组织防御反应的表达，发酵液提取物对POD、PPO有良好的诱导作用，菌丝体提取物对PAL、POD和PPO均有较好的诱导效果。

放线菌；人参愈伤组织；PAL；POD；PPO

诱导抗病性是植物抗病防御反应的一种重要表现形式，具有非特异性［1，2］。近年来研究发现一些生防微生物可以作为诱导因子，促使植物体内防御酶活性发生变化，从而提高自身的免疫力，增强抗病性，最终使植物获得抵御病害的能力。因此，防御酶被认为是植物抗病机制的关键之一［3，4］，当植物受到环境胁迫时，体内会大量合成一系列重要的防御酶，主要包括苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL），过氧化物酶（Peroxidase，POD），多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）等。

在植物抗病反应中，PAL是苯丙烷代谢途径的关键酶和限速酶，它能催化L-苯丙氨酸形成反式肉桂酸，可促进产生植保素类物质，如类黄酮、木质素和水杨酸（Salicylic acid，SA）（植物抗病反应的重要信号分子）的形成，所以PAL酶活性可作为植物抗逆境能力的一个生理指标［5］。一般研究认为其活性升高，植物抗病性增强，活性降低，抗病性减弱［6］。POD是植物抗病反应中的关键性酶，是植物所产生的一类氧化还原酶，能水解多余的细胞毒性物质H2O2和OH-，同时POD也是木质素生物合成中最后一步的关键酶［7］，木质素具有限制病原菌酶和毒素向寄主扩散、控制水和营养物由寄主向病原菌扩散、抑制病原菌生长和增殖的作用。PPO可以把酚类物质氧化为相应的醌类物质，醌类物质对病原微生物起着抑制作用或杀伤作用，具有一定的抗病能力［8］。PPO同时还参与木质素的合成，使细胞壁增厚来抵御病菌的侵入和扩展，从而抑制发病。

放线菌FX-139为本实验从吉林省抚松县万良镇人参栽培基地土壤分离得到，为酒红土褐链霉菌（Streptomyces vinaceus-drappus），滤纸片法显示其对7种人参病原菌具有良好的拮抗性。此外，还发现其发酵液的正丁醇提取物和菌丝体丙酮提取物对人参常见病病原菌均有抑制作用（结果另文报道）。但对人参植株的生长状况和是否可以作为诱导因子，引起植物体内防御酶发生变化，提高植物的抗病性的研究并不明确。本研究以此为切入点，研究放线菌FX-139对人参愈伤组织生长量和相关防御酶活性变化的影响，旨在初步探讨FX-139的抗性诱导机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌 放线菌FX-139为酒红土褐链霉菌（Streptomyces vinaceus-drappus）由吉林农业大学中药材学院生态恢复与生态系统管理重点实验分离、保存。

1.1.2 人参愈伤组织 人参愈伤组织由吉林农业大学中药材学院植物生态学与化学实验室提供。

1.1.3 主要培养基 高氏一号培养基；ISP2液体培养基；改良MS培养基。

1.2 方法

1.2.1 FX-139发酵液提取物的收集 FX-139在高氏一号平板培养基上进行活化后，将菌饼接入发酵液体培养基中，28℃下在摇床中培养48 h（180 r/min），得到种子液。种子液以10%的接种量接入液体培养基中进行二次发酵，振荡培养7 d后，在10 000 r/min下离心20 min后取上清。上清液以水饱和正丁醇反复萃取3次，比例为1∶1，收集萃取液，减压浓缩至浸膏，计算得率后，放入4℃冰箱中备用。

1.2.2 FX-139菌丝体提取物的收集 将1.2.1离心得到的菌丝体以2倍体积的80%丙酮浸泡，超声破碎（70 Hz，35℃，30 min）。重复3次后收集丙酮提取液，减压浓缩至浸膏，即得菌丝体提取液，计算得率后，放入4℃冰箱中备用。

1.2.3 供试培养基的制备 将1.2.1和1.2.2中收集到的发酵液提取物及菌丝体提取物配制成1 g/L的母液，无菌条件下微孔滤膜（0.22 μm）过滤除菌，将无菌滤液加入MS培养基中，使培养基的终浓度分别为10、20、50、100、200 及500 mg/L，对照为蒸馏水，待培养基凝固即得供试培养基。

1.2.4 愈伤组织生长情况测定 先称取制备好的空培养基重量，然后在无菌条件下接入愈伤组织后称取总重量，接种后总重量与空培养基重量之差即为接种量，控制每瓶接种量尽量一致，每个处理3次重复。接种后置于21℃的培养箱中，暗环境下培养28 d，然后取出愈伤组织称量其重量，得出愈伤组织生长量，愈伤组织增长量=收获量-接种量；愈伤组织增长率（%）=愈伤组织增长量/接种量×100%［9］。

1.2.5 愈伤组织防御酶的测定 直接在无菌条件下接种人参愈伤组织，置于培养箱中在21℃、暗环境下培养28 d。其中，每隔7 d从培养瓶中取出适量的愈伤组织，液氮迅速冷却，置于-80℃的超低温冰箱中，用于愈伤组织的酶活性测定。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的测定：参考文献［10，11］，过氧化物酶（POD）活性的测定：采用愈创木酚法［10］，多酚氧化酶（PPO）活性的测定：采用紫外分光光度法［12］。

1.2.6 数据处理 用 DPSv7.05对试验数据进行统计分析。采用Williamson的方法评价FX-139发酵液提取物和菌丝体提取物对愈伤组织生长量的影响［13］，即：RI=（T1/T0-1）。其中，RI为发酵液提取物和菌丝体提取物对愈伤组织生长量的效应指数，T1为两种提取物处理下人参愈伤组织的生长量，T0为对照人参愈伤组织的生长量。当RI＞ 0为促进，RI＜ 0为抑制，绝对值的大小与作用强度成正比［14］。

2 结果

2.1 FX-139发酵液提取物和菌丝体提取物对愈伤

组织生长量的影响

由表1可见，FX-139发酵液提取物和菌丝体提取物对愈伤组织生长量的影响程度与浓度密切相关，呈典型的“低促高抑”的浓度效应。两者对人参愈伤组织增长促进作用最大的均为20 mg/L的处理，分别增加68.96%（发酵液）、51.60%（菌丝体），与CK差异显著。其次，随处理浓度不断增加，抑制作用不断增强，与CK相比，发酵液50-500 mg/L处理下开始对受体具有显著的抑制作用，抑制率分别为18.1%、19.2%、28.1%和47.9%，平均抑制率为28.3%，化感效应值分别为-0.192、-0.53、-0.281、-0.479；平均化感效应为-0.283。菌丝体提取物从100 mg/L开始对愈伤的生长出现抑制作用，抑制率为28.06%。100-500 mg/L处理下抑制率分别为9.7%，25.2%和32.3%，平均抑制率为22.4%，化感效应值分别为-0.097、-0.252、-0.323；平均化感效应为-0.224。

表1 FX-139发酵液和菌丝体提取物对人参愈伤组织生长量的影响

2.2 发酵液及菌丝体提取物对人参愈伤组织防御酶系诱导抗性的影响

2.2.1 FX-139发酵液提取物对人愈伤组织防御酶系的诱导抗性影响 发酵液提取物处理下人参愈伤组织PAL酶活性变化，如图1-A所示。CK处理下PAL总体看来活性变化在7-14 d略有下降，14 d后酶活性变化平稳，表明接种7 d后愈伤组织逐渐适应了继代培养基，逐渐趋于稳定生长。10-50 mg/L浓度范围内，酶活性变化趋势与CK一致但始终低于CK，且随着培养时间的延长，酶活性逐渐降低；100-500 mg/L处理下酶活性变化呈“单峰型”。各浓度处理下在14 d后PAL酶活值均低于CK，平均降低了24.81%。100-500 mg/L处理在培养21-28 d时出现活性增大的情况，其中500 mg/L处理与CK差异显著，比CK提高了1.29倍。表明发酵液100-500 mg/L处理可促使人参愈伤组织PAL酶活性增强。

发酵液提取物处理下人参愈伤组织POD酶活性变化，如图1-B所示。培养周期内，CK处理下POD活性较稳定，主要在28.4-41.2 U/mg范围内变化，21 d有微弱增加，10 mg/L处理下在愈伤组织整个生长周期均与CK保持一致。在愈伤组织生长前期，20-100 mg/L处理下酶活性的变化趋势与CK一致，但随着处理浓度增加，第21天20-100 mg/L处理下活性大幅度提高，达到活性峰值，最大值比CK提高1.60倍，差异显著，而随浓度的增加，处理200-500 mg/L活性高峰提前至第14天出现，最大值比CK提高2.50倍，差异显著。由此可见，发酵液可显著影响POD酶的活性，提高其活力或改变其变化趋势。

发酵液提取物处理下人参愈伤组织PPO活性变化，如图1-C所示。各浓度处理下PPO酶活性变化为“单峰型”。CK最高值出现在21 d，总体看来活性变化平稳。接种愈伤7 d后10-100 mg/L处理下酶活性低于CK，平均降低了15.63%。200-500 mg/L处理下均高于CK。第14天 200-500 mg/L处理下酶活性下降，但始终高于CK，10-100 mg/L处理下酶活性却提高来完成对愈伤组织的保护作用，其中100 mg/L处理下酶活性变化较为明显，酶活性为CK的2.12倍，差异显著。14 d后各处理下酶活性均高于CK，表现为随着时间和浓度的升高，酶活性提高，愈伤组织诱导抗性增强，10-100 mg/L处理下酶活性达到峰值，最大值为CK的1.66倍，但21 d后随着培养时间的延长，酶活性逐渐下降，但始终高于CK。而浓度为200-500 mg/L处理下酶活性依然呈上升趋势，第28天达到峰值，最大值为CK的2.05倍。表现为高浓度处理可以延长PPO活性表达的时间。

图1 FX-139 发酵液提取物对防御酶活性的影响

2.2.2 FX-139菌丝体提取物对人愈伤组织防御酶系的诱导抗性影响 菌丝体提取物处理下人参愈伤组织PAL活性变化，如图2-A所示。各浓度处理下PAL活性变化为“单峰型”，200-500 mg/L处理下酶活性与CK变化趋势始终一致。接种愈伤7 d后菌丝体提取物各浓度处理下的酶活性均高于CK，最大值为CK的1.27倍。7-14 d在200-500 mg/L处理下PAL活性都有不同程度的下降，但始终高于CK，最大值为CK的1.90倍。第21天各处理条件下酶活性均达到峰值，最大值为CK的1.69倍，随着培养时间的延长21 d后各处理条件下酶活性均有不同程度的下降，但始终高于CK。

菌丝体提取物处理下人参愈伤组织POD活性变化，如图2-B所示。各浓度处理下PAL活性变化为“单峰型”。接种愈伤7 d后各处理下酶活性均高于CK。14 d时除10-20 mg/L处理外所有处理酶活性均提高，达到峰值，其中以100 mg/L处理最为明显，最大值为CK的2.60倍。10-20 mg/L处理下在第21天达到峰值，最大值为CK的1.70倍。21 d后随着培养时间的延长，POD活性均有不同程度的下降。综上所述，随浓度的增加，POD的活性高峰期提前。由14 d提前到7 d，20-500 mg/L对人参愈伤组织POD有良好的诱导作用。

菌丝体提取物处理下人参愈伤组织PPO活性变化，如图2-C所示。各浓度处理下PAL活性变化为“单峰型”。CK处理下PPO总体看来活性变化平稳。接种7 d后各浓度处理下PPO活性均接近CK。接种14 d后10-100 mg/L处理下PPO活性均有不同程度下降，但始终高于CK，最大值为CK的1.15倍，浓度200-500 mg/L处理下酶活性到达峰值，最大值为CK的1.40倍，接种14-28 d后各浓度处理下酶活性依然升高，10-100 mg/L处理下酶活性直线上升，与28 d到达活性高峰，最大值为CK的1.32倍。综上所述，20-100 mg/L处理下酶活性平均为CK的1.25倍，诱导效果好于200-500 mg/L的处理。由此也可以看出，在菌丝体诱导抗性的过程中PPO响应滞后，在人参愈伤组织生长末期提高来保护愈伤组织。

图2 FX-139菌丝体提取物对防御酶活性的影响

3 讨论

在研究发酵液提取物和菌丝体提取物对愈伤组织生长量的影响过程中发现，相同浓度下发酵液的促进或抑制活性均强于菌丝体，推测可能与微生物释放到培养液中的代谢物质的积累有关。

放线菌FX-139不同浓度发酵液和菌丝体提取物处理人参愈伤组织后，愈伤组织中防御酶PAL、PPO和POD的活性均发生明显变化。在发酵液提取物诱导抗性的过程中，PAL、PPO、POD由于浓度不同导致变化趋势各不相同，发酵液对PAL的影响主要表现为低浓度抑制，高浓度促进，PAL在浓度100-500 mg/L处理下在第21天活性达到高峰，而POD各个浓度处理下酶活性均高于CK，且差异显著。POD是防御酶清除活性氧系统的第一道防线，植物遭遇病原菌入侵后POD首先发挥作用。隋丽等［15］将放线菌769发酵液处理水稻植株叶片，研究主要防御酶活性变化，发现769菌株发酵液提高过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性。以发酵液原液的作用效果最为显著，本研究与上述报道基本相符。

在菌丝体提取物诱导的抗性过程中，PAL在各浓度处理下活性均高于CK，且差异显著，其中以20 mg/mL在第21天诱导能力最大，此浓度对人参愈伤组织的生长有明显的促进作用。POD在接种愈伤组织7 d后各处理下酶活性均高于CK，其中浓度为20 mg/L处理下第21天酶活性达到峰值。说明菌丝体提取物对PAL、POD均有良好的诱导抗性作用。而在发酵液和菌丝体两种处理下PPO活性均有不同程度提高，呈现先升后降的趋势，这与王婧等［16］使用放线菌的发酵液灌根后测定白菜植株体内防御酶系的变化结果基本吻合。

本研究中PAL、PPO 和 POD受发酵液和菌丝体提取物诱导的影响各不相同，主要是在对这3种防御酶表达时间和活性的提高存在差异，这可能是FX-139发酵液和菌丝体提取物对人参愈伤组织生理生化代谢的影响不同所致。FX-139发酵液和菌丝体提取物不仅对人参常见病病原菌有明显的抑制作用，还可通过诱导人参愈伤组织防御酶活性的变化而增强人参植株的抗病性。这表明放线菌FX-139所产生的活性物质在具有抑菌作用的同时还具有广谱的诱导抗性，具体何种成分起关键作用还有待于进一步研究。

4 结论

本研究以人参土壤中分离纯化的生防菌株放线菌FX-139的发酵液和菌丝体提取物为供体，研究了其对人参愈伤组织生长的影响，以及诱导受体抗逆酶活性的能力。低浓度的发酵液和菌丝体提取物对人参愈伤组织的生长均有促进作用，以20 mg/L的处理最好。发酵液提取物不同浓度处理下既提高了防御酶POD、PPO的活性，同时也保证了愈伤组织正常生长，说明发酵液提取物对POD、PPO有良好的诱导抗性作用。菌丝体提取物对PAL、POD和PPO均有良好的诱导抗性作用。

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（责任编辑李楠）

The Effect of the Fermented Liquid and Mycelium Extract of FX-139 on the Growth and Defense Enzymes of Ginseng callus

Guo Shuangshuang Shi Ce Han Mei Yang Limin
（College of Herbal Medicine，Jilin Agricultural University，State Key Laboratory for Ecological Restoratipn and Ecosystem Management of JLPMOST Collective Construct-KLUER，Changchun130118）

Using the fermented liquid and mycelium extract of actinomycetes FX-139 isolated from ginseng rhizosphere as the donor，the effects of it on the growth and ability of inducing defense enzyme activity of ginseng callus were studied. The results showed that: （1）The treatment of FX-139 fermented liquid and mycelium extract at the concentration of 20 mg/L had the strongest promoting effect on Ginseng callus growth， increasing 68.96% and 51.60% higher than that in the control， i.e.， there was significant difference. （2）There was an active peak of PAL， POD and PPO in 21 d， 14 d and 28 d respectively under the treatment with water saturation n-butyl alcohol extract of fermented liquid， it raised 1.29 times， 2.5 times， and 2.12 times against the control group respectively. There was an active peak of PAL， POD and PPO in 21 d， 14 d and 14 d respectively under the treatment with acetone extract of mycelium， it raised 1.9 times， 2.6 times， and 1.4 times against the control group respectively. （3）The change of defense enzyme activities in ginseng callus was detected. PAL， POD and PPO enzyme activity were obviously changed with the treatment of fermented liquid and mycelium extract. Overall， Ginseng callus defense responses could be induced by fermented liquid and mycelium extract of FX-139. Fermented liquid extract could effectively induced POD and PPO， and mycelium extract could effectively induced PAL， POD and PPO.

actinomycetes；Ginseng callus；PAL；POD；PPO

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.020

2014-08-27

国家科技支撑计划项目（2011BAI03B01-02），国家自然科学基金项目（31270371），吉林省科技发展计划重点项目（20125068）

郭双双，男，硕士生研究生，研究方向：微生物及分子生物学；E-mail：1530811226@qq.com

杨利民，男，博士，教授，研究方向：中药资源生态与药材质量调控；E-mail：ylmh777@126.com