牦牛CAV-3基因的克隆及其在牦牛和黄牛组织的表达分析

赵娟花 裴杰 梁春年 郭宪 吴晓云 张良斌 阎萍

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所　甘肃省牦牛繁育工程重点实验室，兰州　730050）

牦牛CAV-3基因的克隆及其在牦牛和黄牛组织的表达分析

赵娟花 裴杰 梁春年 郭宪 吴晓云 张良斌 阎萍

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所甘肃省牦牛繁育工程重点实验室，兰州730050）

旨在对牦牛CAV-3基因进行克隆、生物信息学分析，并对其在牦牛组织中的表达规律进行初步研究。根据GenBank数据库中已知的黄牛CAV-3基因的mRNA序列并设计特异性引物，应用RT-PCR技术克隆牦牛CAV-3基因的编码区。运用生物信息学方法，分析并预测牦牛Caveolin-3蛋白的理化性质、疏水性、蛋白结构域以及蛋白质二级结构。通过半定量PCR技术检测CAV-3基因mRNA在牦牛和黄牛各组织中的表达；利用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和黄牛肌肉组织中CAV-3基因 mRNA表达水平。牦牛CAV-3的编码区全长631 bp，共编码151个氨基酸。CAV-3在牦牛肺、脾脏、肾脏、肝脏、卵巢组织中均不表达，仅在心脏和肌肉组织中表达，且在心脏组织的表达水平高于肌肉组织，CAV-3基因在黄牛各组织中的表达结果与牦牛一致。CAV-3基因在牦牛肌肉中的表达低于黄牛肌肉组织，但差异不显著（P＞0.05）。

牦牛；Caveolin-3；克隆；表达分析

小窝（caveolae），又称胞膜窖，是细胞膜上直径为50-100 nm左右的囊泡凹陷结构，广泛存在于多种类型细胞膜上。在上皮细胞、脂肪细胞和肌肉细胞的质膜中含量较为丰富［1，2］。小窝蛋白（Caveolin），又称窖蛋白，是构成小窝基本组分的一类标志蛋白［3，4］，其分子量在21-24 kD之间。目前，已知有4种窖蛋白Caveolin-1（α，β两种亚型）、Caveolin-2和Caveolin-3分别由哺乳动物的CAV-1，CAV-2，CAV-3基因编码组成［5］。Caveolin-1可单独或与Caveolin-2协作形成稳定的寡聚体复合物，并广泛存在于内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞等细胞中［6，7］。据报道，Caveolin-3是整合在 caveola上的肌细胞特异性蛋白，且可能与肌肉的发生以及功能的维持有关［8］。该蛋白广泛存在于多种肌细胞中，如心肌细胞、骨骼肌细胞等［9］。因此，探究CAV-3基因的功能及在肌肉发生过程中的作用，对更好地开展有关牦牛肌肉性状的育种工作具有一定的参考价值。有报道称，在人类骨骼肌纤维中慢肌的CAV-3表达量远远低于快肌中CAV-3的表达量，这表明CAV-3在调控肌纤维的发育类型和生长发育上有重要作用［10，11］。目前，对CAV-3基因的研究仅限于人和小鼠上，尚无该基因在牦牛和黄牛上的研究报道。本研究以甘南牦牛为研究对象，对牦牛CAV-3基因编码区序列进行克隆，对通过CAV-3基因编码区推断获得的CAV-3蛋白序列进行蛋白特征分析，比较该基因的mRNA在牦牛和黄牛肌肉组织中的表达差异，旨在为研究该基因在肌肉发生和肌肉生理过程中的可能作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 试验用3岁母牦牛选自甘南藏族自治州，3岁母黄牛选自临夏回族自治州。待牛屠宰后，采集牛的背最长肌、肾脏、肝脏、心脏、卵巢、脾脏和肺组织，保存于液氮中迅速带回实验室。

1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒、pMD19-T克隆载体和DNA Marker购自大连宝生物（TaKaRa）公司；琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒、Taq酶Mix、质粒提取试剂盒、E.coli DH5α、X-gal、IPTG购自北京天根公司；琼脂粉、胰蛋白胨和酵母浸出粉购自 OXOID 公司。

1.1.3 引物设计与合成 根据 GenBank中黄牛CAV-3基因中的mRNA序列（登录号：NM_001046558）和GAPDH mRNA序列（登录号：NM_001034034），利用 Premier 5.0 分别设计牦牛CAV-3 基因全编码区的扩增引物、定量 PCR引物及内参引物，并由大连宝生物公司合成。引物序列、退火温度及PCR产物长度，见表1。

表1 引物序列及其扩增特性

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 以采集的牦牛和黄牛的背最长肌及其它组织为材料，根据RNA提取试剂盒的使用说明提取RNA，使用分光光度计和1.2%琼脂糖凝胶电泳分别检测所获RNA的纯度和完整性，并置于-80℃保存。

1.2.2 RT-PCR 按照反转录试剂盒的说明进行反转录反应，以所获RNA为模板合成所需cDNA。在PCR管依次加入5×g DNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，RNase Free H2O 6 μL，总RNA 1 μL，混匀后在42℃ 2 min，85℃ 5 s条件下反应。待上述反应结束后，在反应液中依次加入5×PrimerSript Buffer 4 μL，RNase Free H2O 4 μL，RT Primer Mix 1 μL，PrimerSript RT Enzyme Mix 1 μL，混合后42℃25 min，85℃ 5 s条件下继续反应，并最终以此反应液为模板进行定量试验。

1.2.3 RT-PCR扩增牦牛CAV-3基因的CDS区 PCR反 应 体 系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，RNase Free H2O 19 μL，10 mmol/L引物F、R各2 μL，cDNA 2 μL。PCR 反应条件：Lid 105℃；95℃预变性4 min；95℃变性30 s，57.6℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃延伸10 min，4℃终止反应。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。

1.2.4 牦牛CAV-3基因CDS区的克隆 将回收的PCR产物与pMD19-T克隆载体连接，在16℃过夜，构建重组质粒。将重组质粒转化至感受态 E.coli DH5α菌中，转化产物于37℃、100 r/min培养90 min，均匀涂在含有Amp、X-gal、IPTG 的LB固体培养基上，37℃培养12 h。挑取白色阳性菌落，于含有Amp的LB 液体培养基过夜培养。PCR扩增鉴定后，将阳性菌落送至上海生工测序公司进行测序。

1.2.5 牦牛CAV-3基因与Caveolin-3蛋白的生物信息学分析 使用GenBank数据库中的BLAST在线检索工具对所获序列进行同源序列比对；用ORF Finder在线程序预测开放阅读框；运用ExPASy网站的Protparam和ProtScale在线工具预测分析牦牛Caveolin-3的基本理化性质和疏水性；采用SignalP3.0、TMHMM Server v.2.0在线分析程序预测Caveolin-3的信号肽位点和跨膜区域；采用Interpro在线分析软件预测的Caveolin-3的蛋白结构域，并用SABLE在线预测网站预测蛋白质的二级结构。

1.2.6 半定量 PCR检测牦牛和黄牛CAV-3基因的表达 定量 PCR反应体系：2×Taq Mix 45 μL，10 mmol/L的上、下游引物各4.5 μL，ddH2O 27 μL，充分混匀后分装到8个PCR 管中各9 μL，再在各管中分别加入1 μL各组织cDNA模板，充分混匀。反应条件：95.5℃ 5 min；95℃ 30 s，57.6℃ 30 s，72℃20 s，30个循环；72℃ 5 min。PCR产物由 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.7 实时荧光定量PCR检测牦牛CAV-3基因表达量 荧光定量PCR反应体系：2×SYBR®Premix Ex TaqTM5 μL，10 mmol/L的上、下游引物各 0.2 μL，ddH2O 4 μL，cDNA 模板0.6 μL，充分混匀。反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，57℃ 30 s，40个循环。试验以GAPDH为内参，每个样品做3个重复，运用2-△△ct的方法计算目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1 牦牛CAV-3基因的PCR扩增

扩增产物经1.2% 琼脂糖凝胶电泳分析，可见一条介于500-700 bp之间的DNA片段，与预期DNA片段（631 bp）大小一致（图1）。

图1 CAV-3基因PCR扩增产物的电泳

2.2 牦牛CAV-3基因的序列测定及分析

鉴定的阳性重组质粒送至上海生工测序公司测序，通过同源序列比对证明构建的重组载体中含有CAV-3基因的全长编码区序列。对克隆的CAV-3基因序列进行开放性阅读框分析，得知CAV-3基因含有一个456 bp的开放性阅读框，编码151个氨基酸，起始密为ATG，终止密码子为TGA（图2）。

图2 牦牛CAV-3基因和编码蛋白的序列

2.3 牦牛Caveolin-3蛋白的生物信息学分析

2.3.1 牦牛Caveolin-3蛋白的理化性质和疏水性/亲水性预测和分析 通过Protparam工具预测牦牛Caveolin-3蛋白的基本理化性质，结果显示该蛋白的分子量为17.2903 kD，理论等电点（pI）为5.75。分子式是C798H1230N192O214S11，总原子数2 445个。含有带负电荷的残基（Asp+G1u）16个，带正电荷的残基（Arg + Lys）13个。该蛋白由常见的20种基本氨基酸组成，其中含量最高的分别是Ile、Leu和Val（均为9.9%），含量最低的分别是Met和Gin（均为2.0%）。运用ProtScale工具分析牦牛Caveolin-3蛋白的亲水性和疏水性，根据氨基酸的分值与亲水性成反比的规律可知：牦牛Caveolin-3蛋白多肽链第30位Lys和第31位Asn具有最低的分值-2.556和最强的亲水性；第83位Pro具有最高的分值2.556和最强的疏水性；且整个多肽链表现为亲水性（图3）。

图3 牦牛Caveolin-3蛋白疏水性分析

2.3.2 牦牛Caveolin-3 蛋白信号肽、跨膜区分析和结构域预测 使用SignalP3.0预测信号肽的分泌途径和切割位点，发现没有信号肽。用TMHMM2.0分析跨膜结构，发现此编码蛋白第1-78个氨基酸位于膜外，第79-101个氨基酸螺旋跨膜，而第102-151个氨基酸位于膜外。结构域是蛋白质中能折叠成特定三维结构的一段区域，是蛋白序列结构和进化单元，具有一定生物学功能。用Interpro在线工具对牦牛Caveolin-3蛋白进行结构域预测，结果（图4）显示该序列在第79-101位氨基酸之间具有一个跨膜结构域。

图4 牦牛CAV-3基因编码蛋白的结构域预测

2.3.3 牦牛Caveolin-3蛋白的二级结构预测 蛋白质的生物学活性和理化性质取决于空间结构，因此预测与分析蛋白质二级结构对了解其空间结构有重要意义。用SABLE服务器预测其Caveolin-3蛋白的二级结构，结果表明该蛋白由67.55% α螺旋、13.91%延伸链和17.88%无规则卷曲组成（图5）。可推断无规则卷曲、α螺旋和延伸链是牦牛Caveolin-3蛋白主要的二级结构元件。

图5 牦牛Caveolin-3蛋白的二级结构预测

2.4 牦牛、黄牛各组织器官中CAV-3基因mRNA表

达水平分析

通过半定量PCR检测分析，在牦牛肝脏、脾脏、肺、肾脏、卵巢组织中均无CAV-3基因mRNA表达，仅在心脏和肌肉组织中有表达，且心脏组织的表达高于肌肉组织（图6）。CAV-3基因mRNA在黄牛各组织中的表达情况与其在牦牛组织表达结果一致（图7）。

图6 半定量 PCR分析CAV-3基因mRNA 在牦牛7个组织器官中的表达

2.5 CAV-3基因在牦牛和黄牛肌肉中的mRNA表达分析

通过实时荧光定量PCR对牦牛和黄牛肌肉组织中CAV-3基因表达水平进行检测。定量结果用SPSS19.0软件进行统计学分析，结果（图8）发现牦牛基因mRNA表达水平低于黄牛，但差异不显著（P＞0.05）。

图7 半定量 PCR分析CAV-3基因mRNA 在黄牛7个组织器官中的表达

图8 CAV-3 mRNA在牦牛和黄牛肌肉组织中的表达水平

3 讨论

长久以来窖蛋白（Caveolin）被认为是组成胞膜窖的基本蛋白结构单元，但是在近期的研究中发现Caveolin-3也是肌纤维横列小管的重要组成部分，特别在发育的肌肉中Caveolin-3扮演着非常重要的角色［12］。本研究首次克隆得到了牦牛CAV-3基因的编码区全长631 bp，共编码151个氨基酸。跨膜域一般是由20个左右的疏水性氨基酸残基组成，是膜内蛋白与膜脂结合的主要部位。通过对跨膜域的预测与分析，对该蛋白质的功能、结构和分布具有了一定的认识和了解。本试验通过生物信息学的方法对Caveolin-3蛋白进行分析，结果表明牦牛Caveolin-3蛋白在第79-101位氨基酸具有一个跨膜结构域。信号肽一般由15-30个氨基酸组成，是疏水性肽片段，位于新合成肽链的N末端，在蛋白质的内质网高尔基体质膜的分泌途径中发挥重要作用［13］。一般可以通过分析蛋白质N端有无存在信号肽，初步判断该蛋白是否为分泌蛋白。本研究表明，牦牛Caveolin-3蛋白不存在信号肽，不属于分泌蛋白。

早期的研究发现，Caveolin-3仅存在于各种肌细胞中，如心肌细胞、骨骼肌细胞和平滑肌细胞等。余方等［13］在对不同发育阶段的鸡的研究中发现，CAV-3 mRNA仅在横纹肌特异性表达而在其它组织器官组织中均未见表达，同时在1-10周的不同发育阶段中未表现出明显的变化，他们认为，CAV-3基因在鸡的小窝膜结构形成、肌肉中T-小管系统的发生和肌肉分化等过程中可能起着非常重要的作用。Song等［14］对小鼠的研究发现CAV-3基因特异表达于心肌、骨骼肌以及血管平滑肌细胞中。张营等［15］对鸭CAV-3基因mRNA在不同组织中表达情况进行的研究发现，CAV-3 mRNA在心肌中表达量最高，在胸肌、腿肌、肾脏中表达量相对较高，在其他组织中痕量表达。本试验利用半定量RCR技术对牦牛CAV-3基因mRNA在不同组织中表达情况进行的研究发现，CAV-3 mRNA在心脏中表达量最高，肌肉组织中表达量次之，其他组织未见表达，这与余方等的研究结果一致。但与张营等对鸭各组织中CAV-3基因的表达研究略有差异，这可能与牦牛的特殊生理构造有关。

CAV-3对哺乳动物和鸟类的肌肉生理功能的维持都起着非常重要的作用。Galbiati等［16］发现敲除CAV-3的小鼠会出现肌纤维中的胞膜窖消失现象，同时发生骨骼肌细胞病理性改变。Galbiati等还发现正常骨骼肌细胞中的肌营养不良蛋白-糖蛋白的复合体被定位在胞膜窖中，当Caveolin-3缺失后这种定位被打乱，从而并发许多相关疾病。Caveolin-3的缺陷使得肌营养不良蛋白-糖蛋白的复合体异常定位，从而引起了人类的肢带型进行性肌肉萎缩症［1］，同时还发现T-小管的异常排列［17，18］，这些缺失后的表型说明了Caveolin-3在肌肉组织发育过程中的重要作用。杨渊等［19］通过荧光定量PCR技术检测了脂肪型的荣昌猪和瘦肉型长白猪的脂肪和肌肉组织中CAV-3基因在7月龄的表达变化，并分析品种间、不同性别间和不同组织间基因表达的差异。结果表明，长白母猪板油中CAV-3基因表达量极显著高于荣昌母猪板油中CAV-3基因表达量（P＜0.01）［20］。本研究利用荧光定量PCR技术检测CAV-3 mRNA在牦牛和黄牛背最长肌组织的表达，发现CAV-3基因在牦牛肌肉组织表达低于黄牛肌肉组织，但是差异不显著，这也验证了CAV-3在骨骼肌中的表达。本研究克隆了牦牛CAV-3基因的编码区序列并分析了其组织表达规律，为进一步研究其功能及在肌肉发生和肌肉生理过程中的作用提供参考。

4 结论

牦牛CAV-3的编码区的序列长度为631 bp，编码151个氨基酸，不含信号肽，其蛋白在第79-101位氨基酸之间具有一个跨膜结构域。CAV-3 mRNA在心脏和肌肉组织中能够特异性表达，且CAV-3 基因mRNA在牦牛肌肉组织的表达水平低于黄牛肌肉组织的表达水平。

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（责任编辑 马鑫）

Cloning of CAV-3 in Yak and Analysis Its Expression in Yak and Cattle

Zhao Juanhua Pei Jie Liang Chunnian Guo Xian Wu Xiaoyun Zhang Liangbin Yan Ping
（Key Laboratory of Yak Breeding Engineering，Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou730050）

This study aims to clone， analyze bioinformatics and determine the expression pattern of CAV-3 gene in yak. A pair of special primers were designed according to released mRNA sequence of bovine CAV-3 in GenBank. A coding region sequence of yak CAV-3 was amplified by RT-PCR； the general physical and chemical properties， hydrophobicity， protein domains and protein secondary structures were systemically analyzed and predicted by bioinformatics techniques. The expression levels of CAV-3 mRNA in some organs of yak and cattle were detected by semi-quantitative PCR. Real-time PCR was employed to examine the expression levels of CAV-3 mRNA in yak and cattle muscles. The coding region sequence of CAV-3 gene in yak contains a complete ORF（631 bp）which encoded 151 amino acids. CAV-3 mRNA expression in the heart and muscle was detected， but not in any other examined tissues， and its expression level in the heart was higher than in the muscle. The result in yak was consistent with that in cattle. Expression of CAV-3 gene in the yak muscle was less than in the cattle muscle，but not significantly（P＞0.05）. The cloning and analysis of CAV-3 provided scientific basis for further study the function of CAV-3 gene in muscle development and muscle physiological process in the future.

yak； Caveolin-3； cloning； expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.030

2014-10-28

现代农业（肉牛牦牛）产业技术体系专项（CARS-38），甘肃甘南牧区“生产生态生活”保障技术集成与示范（2012AD13B05）

赵娟花，女，硕士研究生，研究方向：动物遗传育种；E-mail：zjh326303202@163.com

阎萍，女，研究员，博士生导师，研究方向；动物遗传育种；E-mail：pingyanlz@163.com