西藏藏猪遗传多样性研究

郭永博 蔡原

（甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州　 730070）

西藏藏猪遗传多样性研究

郭永博 蔡原

（甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070）

采用mtDNA D-loop作为分子标记，对西藏的4个藏猪群体（林芝、山南、昌都和日喀则）遗传多样性进行了研究。结果表明，西藏藏猪mtDNA D-loop高变区A+T含量（62.90%）明显高于 G+C 含量（37.1%），富含A和T，存在碱基偏倚性。在长度为435 bp的序列中，共检测到20个变异位点，界定了26个单倍型，单倍型多样度（Hd）为0.705±0.021，平均核苷酸差异数（k）为1.231，核苷酸多样度（Pi）为0.002 83。其中，Hd、k和Pi在昌都藏猪群体中最高，日喀则藏猪最低。此外，Hap1和Hap3单倍型是4个群体的共享单倍型，表明4个藏猪群体存在两个共同的母系祖先单倍型。

藏猪；mtDNA D-loop；单倍型；遗传多样性

藏猪是世界上少有的高原型猪种，是唯一能够适应高原海拔气候和以放牧为主的猪种［1］。藏猪主产于青藏高原，包括云南迪庆藏猪、四川阿坝及甘孜藏猪、甘肃的合作猪以及分布于西藏自治区山南、林芝、昌都等地的藏猪类群。由于近年来繁殖育种手段不断改进，高强度选育，加之生态环境的改变，致使许多拥有丰富遗传资源的地方品种数量锐减，纯种藏猪的分布范围和数量正在不断减少，已面临种群灭绝的危险［2］。因此，最大限度地保存藏猪的遗传多样性是藏猪保护与利用面临的突出问题。

mtDNA D-loop，即mtDNA的非编码区，该区的进化速率较其他区域高5-10倍，是目前mtDNA研究的热点，被广泛应用于哺乳动物遗传多样性和种内、种间亲缘关系等方面的研究［3-5］，甘佳等［6］以微卫星标记测定了四川境内阿坝、稻城和德格3个藏猪遗传多样性。近年来，应用mtDNA研究猪的遗传多样性及系统发育比较多［7-9］，Gou等［10］评估了随机和选择性繁殖猪种群之间的遗传多样性，结果表明随机繁育种群单倍型多样性显著大于选择性繁育种群；Li等［11］研究了西藏野猪的遗传适应与高海拔有关，表征了家猪唾液分泌增加的遗传基础；Jiao等［12］测定藏猪的遗传多样性发现，合作猪目前具有较高的遗传多样性，可以进行合理利用；Zhao等［13］利用mtDNA研究了中国猪的起源和演化，表明了中国国内猪可能是起源于野生长江中游地区及中国南方的公猪；Gou等［14］通过研究藏猪、亚洲家猪和野猪mtDNA高变区，认为在西藏高原和东南亚岛屿地区存在家猪的两个新的起源中心；张亚平等［15］测定了云南4 个地方猪品种的mtDNA D-loop高变区，结果显示mtDNA 多态能有效作为品种内遗传多样性指标，及云南4个地方猪品种大多数个体起源于一个野猪亚种［15］。以mtDNA分子标记研究西藏藏猪遗传多样性报道较少，因此，本研究对分布在西藏4个藏猪mtDNA D-loop高变区序列进行研究，以期为藏猪资源保护提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究采集了西藏林芝藏猪、山南藏猪和昌都藏猪3个群体共267头藏猪血液样品，详见表1。

1.2 方法

1.2.1 试验方法 参照 《分子克隆实验指南》［16］，采用常规酚-氯抽提法提取基因组DNA。根据发表在GenBank中的西藏藏猪mtDNA D-loop序列（Accession：AF486868）设计引物：上游引物（PL16405）：5'-ATACCAATCACTAGCATCAT-3'；下游引物（P-H653）：3'-CCGGATCATGAGTTCCATGAAGT-5'。

进行聚合酶链式反应，PCR扩增反应体系体积 为：60 μL， 其 中：10×Buffer 5.0 μL（Mg2+1.5 mmol/L）、dNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL、上下游引物各5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL、模板DNA 1 μL，加双蒸水至28.0 μL。扩增条件：94℃ 2 min；94℃ 20 s，58℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35个循环；72℃ 10 min，4℃保存。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物送上海生工生物工程股份有限公司纯化并进行双向测序。

1.2.2 数据处理 测得的原始序列，通过Chromas-Version2.33（http：//www.technelysium. com.au/chromas. html）进行人工编辑，校对电泳峰图与碱基对应关系，剪切非研究区域序列。分析中引用来自于GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）的西藏藏猪相关序列，见表1。并用 MEGA 5.0（http：//www.megasoftware.net）建立序列数据库，采用 Clustal X 1.8（http：//www.igbmc.ustrasbg.fr/pub/ ClustalX）进行同源序列比对分析。采用 DnaSP 5.10.1（http：//www.ub.edu/dnasp）进行核苷酸变异位点、单核苷酸多态性、单倍型数目、单倍型多样性分析以及计算单倍型多样度、核苷酸多样度和平均核苷酸差异度。

表1 样品信息

2 结果

2.1 mtDNA D-loop高变区SNPs分析

西藏藏猪mtDNA D-loop高变区经扩增、 测序、编辑后，获得长度为435 bp核苷酸序列。用MAGE5.0软件进行碱基分析发现，T、C、A和G 4种核苷酸的平均比例分别为27%、24%、35.90%和13.10%，A+T 含量（62.90%）明显高于 G+C 含量（37.1%），可见藏猪mtDNA D-loop高变区富含A和T，同时体现了哺乳动物线粒体DNA碱基组成的基本特点。利用Dnasp5.10.1软件对4个藏猪446个个体的 mtDNA D-loop 区进行单核苷酸多态性分析（single nucleotide polymorphism，SNP），共检测到20个多态位点，占所测核苷酸的4.60%，说明该核苷酸序列突变率小，有较好的稳定性，其中有3个单一多态位点和17个简约信息位点（表2）。

表2 西藏藏猪mtDNA D-loop高变区变异位点数统计

碱基变异数（S）分布结果（图1-A）表明，在第1-40个碱基之间没有发现碱基变异，说明这是一个相对保守的区域，变异区在第41个碱基与435个碱基之间，而高变区集中在第 157-417 碱基之间。核苷酸多样度（Pi：序列间每个位点的平均核苷酸差异数）变化趋势（图 1-B）显示，D-loop区核苷酸多样度最高峰值出现在第250碱基左右（图1）。

图 1 mtDNA D-loop高变区序列碱基变异（A）及核苷酸多样度（B）分布

2.2 遗传多样性分析

核苷酸多样性分析表明，西藏藏猪单倍型多样度（Hd±Sd）、核苷酸多样度（Pi）和平均核苷酸差异数（k）分别为0.705±0.021、0.002 83和1.231。其中，山南藏猪和昌都藏猪两个群体的3个多样性参数均高于西藏藏猪的整体水平，而林芝藏猪和日喀则藏猪群体均低于整体水平（表3）。无论从单倍型数、单倍型多样度还是核苷酸多样度来看，昌都藏猪遗传多样性最高，而日喀则藏猪最低。

表3 西藏藏猪mtDNA D-loop遗传多样性

2.3 单倍型分析

西藏藏猪单倍型分析表明，根据检测到的20个多态位点，界定了26个单倍型（Hap1-Hap26，表4）。其中，两个及以上群体的共享单倍型共有13个，而4个群体共享的只有2个（Hap1和Hap3）。群体间的特有单倍型数差异较大，除日喀则藏猪没有特有单倍型，其他3个群体都存在特有单倍型，其中林芝藏猪特有单倍型数最多（6个），占单倍型总数的23.08%，山南藏猪特有单倍型最少（3个）。单倍型频率差异较大，Hap1单倍型频率最高，有229个个体，Hap6、Hap3、Hap9和Hap16频率依次降低，个体数分别为51、42、32和29。其余11个单倍型频率都低于10。

表4 西藏藏猪mtDNA D-loop高变区变异位点分布

3 讨论

3.1 藏猪mtDNA D-loop高变区序列特征

由于饲养量下降和杂交改良等因素，藏猪资源受到严重威胁［17］，现已被列入《 国家级畜禽遗传资源保护名录》。开展藏猪种质资源调查研究，可为其遗传资源保护提供科学依据。本研究通过西藏藏猪mtDNA D-loop序列遗传多样性来揭示遗传资源的保护必要性。在分析的446头西藏藏猪mtDNA D-loop长度为435 bp的核苷酸序列中，不考虑插入、缺失和 Poly（C）末端长度变异的条件下，共检测到20个变异位点，占核苷酸总数的4.60%，表明西藏藏猪具有较低的遗传变异，其中，昌都藏猪碱基变异位点数最多（16个），日喀则最少（2个），说明昌都藏猪受选育程度和人工选择机率较其他3个群体高，而日喀则藏猪可能由于地域差异、长期近交使得基因群体内具有较高的遗传一致性，这与蔡原等［7］研究一致。mtDNA分子是由很不均一的片段构成的，G+C含量在21%-50%，其中无脊椎动物为21%-43%，脊椎动物为37%-50%［18］，本试验中为37.10%，略高于变化范围最低值。碱基组成分析表明，A+T平均含量62.90%，显著高于G+C含量37.10%。其中，A+T的含量可以反映出序列的变异性，具有高比例的A+T可能是 D-loop 序列变异较快的原因之一，同时也说明mtDNA D-loop高变区富含A、T，表现出很强的碱基偏倚性，这一结果与mtDNA D-loop 序列进行家禽［19，20］、羊［21，22］、牛［23，24］和猪［25，26］等家养动物的研究结果一致。

3.2 西藏藏猪遗传多样性分布规律

单倍型多样度（Hd）和核苷酸多样度（Pi）是衡量一个mtDNA 变异程度的两个重要指标，Hd值和Pi值越大，多样性程度越高，遗传多样性越丰富，反之，多样性程度越低，遗传多样性越贫乏。另外，mtDNA的单倍型多样性指数也可以衡量种内的变异程度，它的含义类似于核DNA的杂合度［27］。据统计同种动物的个体之间的平均核苷酸顺序奇异值在0.3%-4.0%，有时甚至可高达10%［28］。本研究的西藏藏猪4个，总的单倍型数20个，单倍型多样度（Hd±Sd）为0.705±0.021，平均核苷酸差异数（k）为1.231，核苷酸多样度（Pi）为 0.002 83。研究结果显示，昌都藏猪、山南藏猪单倍型多样度、平均核苷酸差异数、核苷酸多样度均高于整体水平，而林芝藏猪低于整体水平，日喀则藏猪明显低于整体水平，并且依次降低，证明昌都和山南藏猪品种的遗传变异程度较高，遗传基础比较广泛，具有丰富的遗传多样性［29］，可能由于昌都藏猪的群体数量较大且分布范围较广，而日喀则藏猪则局限在一个较为封闭的环境中，与其它群体之间基因交流的机会极少［30］。基于mtDNA D-loop序列对梅山猪、二花脸、苏钟猪和保山猪遗传多样性分析表明，其Hd和Pi值分别为0.784、0.400、0.838、0.883和0.005 6、0.000 9、0.004 7、0.003 9，表明二花脸的多样性低于其他3个猪种［31］。采用相同的研究方法研究表明合作、迪庆、甘孜、阿坝4个藏猪群体Hd分别为0.963、0.930、0.303和0.830，Pi分别为0.008 2、0.005 5、0.000 7和0.003 6［12］。本研究中，藏猪Hd和Pi分别为0.705和0.002 83，与梅山猪、二花脸、苏钟猪和保山猪及藏猪合作群体、迪庆群体和阿坝群体相比，其遗传多样性仅高于二花脸猪和藏猪中的甘孜群体，说明了西藏藏猪群体受人工选择的影响小，长期自然条件产生的突变类型在该群体中得到积累，但可能由于与外界交流少，群体内近亲高度繁殖，使其遗传多样性比较有限［32］。同时，瓶颈效应与人工选择共同导致了西藏藏猪等在内的中国家猪遗传多样性的降低，特别是高强度选择猪种对地方猪种的杂交产生的后果更为严重。对26个单倍型进行区域分布研究发现，昌都藏猪单倍型多样度最高，也高于西藏藏猪的整体水平，同时相对于其它3个群体，单倍型数最多，也说明昌都藏猪的遗传多样性最丰富。联合国粮农组织历年关于家养动物报告中都涉及到有关遗传多样性调查的内容，不断改进和完善保存理论和保存机制，不断加大各区域保种项目的投资力度［33］，因此，在藏猪遗传资源保护过程中应该遵循遗传多样性原则进行优先保护。

3.3 西藏藏猪系统发生关系

Hap1和Hap3是4个群体的共享单倍型，说明可能具有共同的两个母系起源。有研究表明，包括藏猪在内的家猪来源于欧洲野猪和亚洲野猪［34-36］，而且是多次驯化事件的结果［37］，就不同藏猪群体而言存在着共同的母系起源，但在几千年的驯化中形成了不同的进化分枝，由于生活环境差异各群体也存在一定数量的特有单倍型，且频率差异较大［25］，其中藏猪的进化分支有一定的地理特征，即群体特异性，欧洲起源家猪与亚洲起源家猪及藏猪明显的分为两个不同的进化枝，在藏猪群体中西藏藏猪与甘孜猪处于同一个进化枝，而合作猪形成了一个相对独立的进化分枝，阿坝猪在各个进化枝中都有出现［12］，而西藏藏猪中除日喀则藏猪没有特有单倍型，其它3个都存在特有单倍型，其中林芝藏猪特有单倍型数最多（6个），占单倍型总数的23.08%，山南藏猪特有单倍型最少（3个）。可能由于日喀则藏猪没有经过长期的自然选择和人工选择，受人工选育的程度低，致使该群体没有形成各自独特的遗传结构，其余3个群体虽然在遗传结构上有独特性，但它们都属于一个地区，与日喀则藏猪群体有密切的关系［38，39］。

4 结论

本研究对西藏藏猪mtDNA D-loop高变区特征、遗传多样性分布规律和系统发生关系研究表明，昌都藏猪的遗传多样性最高，山南藏猪、林芝藏猪、日喀则藏猪遗传多样性依次降低，说明昌都藏猪的群体数量较大且分布的范围较广，而日喀则藏猪则局限在一个较为封闭的环境中，群体间相距较远，基因交流的机会较少，外界交流较少，群体内高度近交繁殖，受人工选育程度低，但它们可能具有共同两个母系起源，在遗传资源保护过程中应遵循遗传多样性原则进行优先保护。

［1］ 辛盛鹏， 石达， 晋美加措， 等. 西藏自治区藏猪遗传资源保护与开发利用研究［J］. 中国牧业通讯， 2011（4）：49-51.

［2］ 强巴央宗， 谢庄， 田发益. 高原藏猪现状与保种策略［J］. 中国畜牧杂志， 2001， 37（6）：46-47.

［3］ Brown WM. Mechanism of evolution in animal mitochondrial DNA［J］. The New York Academy of Sciences， 1981， 361（1）：119-134.

［4］ Grossi SF， Lui JF， Garcia JE， et al. Genetic diversity in wild（Sus scrofa scrofa）and domestic（Sus scrofa domestica）pigs and their hybrids based on polymorphism of a fragment of the D-loop region in the mitochondrial DNA［J］. Genet Mol Res， 2006， 5（4）：564-568.

［5］ Royo LJ， Alvarez I， Beja-Pereira A， et al. The origins of Iberian horses assessed via mitochondrial DNA［J］. Journal of Heredity，2005， 96（6）：663-669.

［6］ 甘佳， 帅素容， 江建平， 李书伟. 四川三个藏猪的微卫星遗传多样性分析［J］. 四川畜牧兽医， 2010， 37（12）：27-29.

［7］ 蔡原， 赵生国. 藏猪遗传多样性研究及系统关系研究［J］. 国外畜禽学：猪与禽， 2011（5）：60-62.

［8］ 杨具田， 臧荣鑫， 卢建雄. 蕨麻猪种质资源保护与开发利用［J］.畜牧与兽医， 2003， 35（12）：15-16.

［9］ 孙俊丽， 张冰， 马青艳， 等. 陆川猪 mtDNA D-loop序列遗传多样性分析［J］. 中国畜牧兽医， 2010， 37（6）：122-125.

［10］ Qu KX，Wu GS，Gou X，et al. Genetic differentiations between randomly and selectively breed pig populations in Yunnan，China［J］. Zoological Research， 2011， 32（3）：255-261.

［11］ Li M， Tian S， Jin L， et al. Genomic analyses identify distinct patterns of selection in domesticated pigs and Tibetan wild boars［J］. Nat Genet， 2013， 45（12）：1431-1438.

［12］ Jiao T， Zhao S， Wang C， et al. Mitochondrial DNA D-Loop diversity of Tibetan Pig populations［J］. The Philippine Agricultural Scientist， 2009， 92（4）：362-369.

［13］ Yu G， Xiang H， Wang J， et al. The phylogenetic status of typical Chinese native pigs：analyzed by Asian and European pig mitochondrial genome sequences［J］. Journal of Animal Science and Biotechnology， 2013， 4（1）：9.

［14］ Yang S， Zhang H， Mao H， et al. The local origin of the Tibetan Pig and additional insights into the origin of Asian Pigs［J］. PLoS One， 2011， 6（12）：e28215.

［15］ 苟潇， 亐开兴， 吴桂生， 等. 云南4个地方猪品种 mtDNA 多态及其起源分化研究［C］// 中国畜牧兽医学会 2004 年学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集（上册）. 北京：中国畜牧兽医学会， 2004：237-241.

［16］ Sambrook J， Russell DW. Molecular Cloning：A Laboratory Manual［J］. 3rd. New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press， 2002：484-485.

［17］ 李云南. 乡城县藏猪资源的保护及建议［J］. 四川畜牧兽医，2009（11）：8-9.

［18］ Jia SG， Chen H， Zhang GX， et al. Genetic variation of mitochondrial D-loop region and evolution analysis in some Chinese cattle breeds［J］. Genet Genomics， 2007， 34：510-518.

［19］ Bhuiyan MS， Chen S， Faruque S， et al. Genetic diversity and maternal origin of Bangladeshi chicken［J］. Molecular Biology Reports， 2013， 40（6）：4123-4128.

［20］ 赵生国. 亚洲部分鸡种系统发育研究及遗传资源优先保护顺序评估［D］. 兰州：甘肃农业大学， 2009：1-117.

［21］ Chen SY， Su YH， Wu SF， et al. Mitochondrial diversity and phylogeographic structure of Chines e domestic goats［J］. Molecular Phylogenetics and Evolution， 2005， 37（3）：804-814.

［22］ 赵倩君. 中国部分绵羊的起源、遗传多样性及保护研究［D］.北京：中国农业科学院， 2007：1-101.

［23］ 赖松家. 中国三个牛种遗传多样性和分子系统进化研究［D］.雅安：四川农业大学， 2004：1-119.

［24］ 雷初朝， 陈宏， 杨公社. 中国部分黄牛品种mtDNA遗传多态性研究［J］. 遗传学报， 2004， 31（1）：55-62.

［25］ Larson G，Dobney K，Albarella U，et al. Worldwide phylogeography of wild boar reveals multiple centers of pig domestication［J］. Science，2005， 307（5715）：1618-1621.

［26］ 姚永芳， 徐怀亮， 杨晓军. 野猪遗传学研究进展［J］. 经济动物报， 2007， 11（2）：112-115.

［27］ Nei M， Tajima F. DNA polymorphism detectable by restruction endonnucleases［J］. Genetics， 1981， 97：145-163.

［28］ Neigel JE， Avise JC. Application of a random walk model to geographic distributions of animinal mitochondrial DNA variation［J］. Genetics， 1993， 135（4）：1209-1220.

［29］ Yang SI， Wang ZG， Liu B， et al. Genetic vari—ation and relationships of eighteen Chinese indigenous pig breeds［J］. Genet Sel Evol， 2003， 35（6）：657-667.

［30］ 陈国宏， 季从亮， 王敏强， Steffen Weigend. 12个中国地方鸡种群体遗传结构及遗传多样性分析［J］. 畜牧兽医学报， 2006，37（2）：105-111.

［31］ 刘益平， 邢光东， 陈仕毅， 等. 苏种猪和太湖猪的线粒体D环部分序列比较分析［J］. 江苏农业学报， 2007， 23（3）：200-203.

［32］ Ai H，Huang L，Ren J. Genetic diversity， linkage disequilibrium and selection signatures in Chinese and Western pigs revealed by genome-wide SNP markers［J］. PLoS One， 2013， 8（2）：e56001.

［33］ FAO. The Global Stratery for the management of farm animal genetic［R］. Rome， Italy， 2007.

［34］ Giuffra E， Kijas JMH， Amarger V， et al. The origin of the domestic pig：independent domestication and subsequent introgression［J］. Genetics， 2000， 154：1785-1791.

［35］ Watanabe T， HayashiI Y， Kimura J， et al. Pig mitochondrial DNA：polymorphism， restriction map orientation， and sequence data［J］. Biochem Genet， 1986， 24：385-396.

［36］ Okumura N， Ishiguro N， Nakano M， et al. Geographic population structure and sequence divergence in the mitochondrial DNA control region of the Japanese wild boar（Sus scrofa leucomystax），with reference to those of domestic pigs［J］. Biochem Genet，1996， 34：179-189.

［37］ Wu GS， Yao YG， Qu KX， et al. Population phylogenomic analysis of mitochondrial DNA in wild boars and domestic pigs revealed multiple domestication events in East Asia［J］. Genome Biol，2007， 8：R245.

［38］ 刘丽， 赵生国， 蔡原， 等. 早胜牛及其杂交群体遗传多样性研究［J］. 农业生物技术学报， 2014， 22（3）：317-325.

［39］ Li JY， Luo Z. Research on the habits and characteristics of Tibet pigs on Tibet Plateau［J］. Ecol Domestic Anim， 1993， 14（1）：18-21.

（责任编辑 马鑫）

The Study of Genetic Diversity in Tibetan Pig of Tibet

Guo Yongbo Cai Yuan
（Faculty of Animal Science & Technology，Gansu Agriculture University，Lanzhou730070）

mtDNA D-loop was selected as a marker to determine genetic diversity of the 4 Tibetan pig populations（Nyingchi， Shannan，Chamdo and Shigatse）in Tibet. The results showed A + T content（62.90%）was significantly higher than the G + C content（37.1%），indicating that Tibetan pigs’ mtDNA D-loop was rich in A and T； there was the presence of a base bias. A total of 20 variable sites and 26 haplotypes were identified in the 435 bp nucleotide sequence of mtDNA D-loop， haplotype diversity（Hd）was 0.705 ± 0.021， the average number of nucleotide differences（k）was 1.231， and nucleotide diversity（Pi）was 0.00283. Among them， Hd， k and Pi were the highest in Chamdo Tibetan pig population， and lowest in Shigatse. In addition， Hap1 and Hap3 were 4 shared haplotypes， revealing that there were 2 common maternal ancestor haplotypes in 4 Tibetan pig populations.

Tibetan pig；mtDNA D-loop；haplotype；genetic diversity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.034

2014-09-10

国家自然科学基金（青年）项目（31101682）

郭永博，男，硕士研究生，研究方向：动物遗传理论与应用；E-mail：guoyongbo016@163.com

蔡原，女，博士，副教授，研究方向：动物遗传育种与繁殖；E-mail：caiyuan@gsau.edu.cn