气相色谱法测定降纤酶中磷酸三丁酯残留量

袁彩君　朱天新

（1 驻马店市中心医院药剂科，河南 驻马店 463000；2 河南欣泰药业有限公司，河南 驻马店 463000）

气相色谱法测定降纤酶中磷酸三丁酯残留量

袁彩君1朱天新2

（1 驻马店市中心医院药剂科，河南 驻马店 463000；2 河南欣泰药业有限公司，河南 驻马店 463000）

目的 建立毛细管气相色谱法测定降纤酶原液中磷酸三丁酯残留量。方法以磷酸三丙酯作内标，采用AT-FFAP色谱柱（30 m×0.32 µm× 0.25 mm）；气化室温度190 ℃；检测器温度210 ℃；柱温140 ℃；载气为氮气。结果磷酸三丁酯在质量浓度2～16 µg/mL内线性关系良好；r为0.9973；质控样品在低、中、高3个浓度下加样回收率分别为98%、101.3%、100.6%，RSD分别为：1.8%、1.08%、2.51% （n=3）。结论该方法快速、准确，适用于降纤酶原液中磷酸三丁酯残留量的测定。

降纤酶；磷酸三丁酯；残留量；气相色谱法；测定

降纤酶是从尖吻蝮蛇毒中提取的蛋白水解酶，能溶解血栓，抑制血栓形成，改善微循环，临床用于急性脑梗死、心肌梗死、肺栓塞、突发性耳聋、血液高凝状态、四肢血管病包括股动脉栓塞，血栓闭塞性脉管炎，雷诺氏病的治疗［1］。注射用降纤酶属多组分生化药注射剂，根据中国药典（2010年版）［2］和国家食品药品监督管理局的相关规定［3］，河南欣泰药业有限公司对其注射用降纤酶采用国际公认的S/D灭活法对原料蛇毒中潜在的病毒进行灭活，该工艺中所加入的磷酸三丁酯［Tri（nbutyl）phosphate，TNBP］对包膜病毒有显著的灭活效果［4-5］。但对小鼠的LD50为602 mg/kg［6］，对人体有害，为保证临床用药安全，根据ICH Q3C《杂质残留溶剂指南》［7］，其残留量应控制在10 µg/10单位（注射用降纤酶装量为1毫升/瓶，规格为10单位、5单位）以下。本研究利用毛细管气相色谱法对注射用降纤酶生产用降纤酶原液TNBP的残留量进行测定，方法准确可靠。

1　仪器与试药

GC-122型气相色谱仪（上海精密科学仪器有限公司）；BHW-2型电热恒温水浴箱（上海医疗器械厂）；80-2B型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；XW-80A型旋涡混合器（上海精科实业有限公司）；注射用降纤酶及其原液（河南欣泰药业有限公司，批号20120301、20120302、20120303）；TNBP：Sigma公司，批号Q0662，纯度＞99.0%；磷酸三丙酯内标物（tripropylphasphate，TPP），Dr Ehrenstorfer公司，批号01222，纯度99.5%；正己烷，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司，批号：20100308；高氯酸，分析纯，北京南尚乐化工厂，批号：20100401。注射用水：由河南欣泰药业有限公司制备。

2　方法与结果

2.1色谱条件。色谱柱：AT.FFAP型毛细管色谱柱，30 m×0.32 µm× 0.25 mm；检测器：氢火焰检测器。柱温：140 ℃；气化室温度190 ℃；检测器温度210 ℃；氮气流速：60 mL/min。

2.2溶液制备

2.2.1TNBP标准工作液：精密称取TNBP 100 mg，用正己烷定容至10 mL，得到10 mg/mL TNBP标准储备液，精密量取TNBP标准储备液600 µL，用正己烷定容至10 mL。

2.2.2内标工作液：精密称取TPP 100 mg，用正己烷定容至10 mL，得到10 mg/mL内标储备液，精密量取内标储备液400 µL，用正己烷定容至10 mL。

2.2.31.5mol/L高氯酸溶液：吸取高氯酸（71%）12 mL用蒸馏水定容至l00 mL。

2.3样品、对照品处理方法

2.3.1样品处理方法：精密量取降纤酶原液或未经病毒灭活工序处理的降纤酶溶液，用注射用水稀释至每毫升约含降纤酶10单位的溶液作为样品溶液。精密量取样品溶液3.0 mL，置具塞玻璃离心管中，精密加内标工作液50 µL与1.5 moL/L高氯酸溶液0.75 mL，振荡1 min，置37 ℃水浴保温10 min后，再加正己烷4 mL，振荡2 min，离心（3000 rpm）20 min，小心吸取上层正己烷，按2.1项下的色谱条件，取1 µL注入气相色谱仪，记录色谱图。

2.3.2对照品处理方法：取TNBP标准工作液10 µL，置于已精密加入3 mL水的具塞玻璃离心管中，精密加内标物工作液50 µL，按2.3.1项下自“振荡1 min”起同法操作。

2.4干扰试验

2.4.1取未经病毒灭活处理的降纤酶溶液，用注射用水稀释至每毫升约含降纤酶10单位的溶液作为样品溶液，精密量取3.0 mL置具塞玻璃离心管中，精密加1.5 moL/L高氯酸溶液0.75 mL，按2.3.1项下自“振荡1 min”起同法操作。

2.4.2精密量取2.4.1项制备的样品溶液3.0 mL置具塞玻璃离心管中，按2.3.1项下自“精密加内标溶液50 µL与1.5 moL/L高氯酸溶液0.75 mL”起同法操作。

图1　磷酸三丁酯测定干扰试验色谱图［①未经病毒灭活处理的降纤酶样品溶液（处理过程中不加TPP和TNBP）；②未经病毒灭活处理的降纤酶样品溶液（处理过程中加入规定量的TPP，不加TNBP）；③TNBP标准品溶液（每毫升含TNBP 2 µg）；④TNBP与未经病毒灭活处理的降纤酶的混合样品（每毫升含降纤酶10单位、TNBP 2 µg］

图2　降纤酶原液（经病毒灭活处理）的磷酸三丁酯检测气相色谱图

2.4.3精密吸取TNBP标准工作液10 µL，置于已精密加入3 mL水的具塞玻璃离心管中，精密加内标工作液50 µL，按2.3.1项下自“振荡1 min”起同法操作。

2.4.4精密量取2.4.1项制备的样品溶液3.0 mL置具塞玻璃离心管中，另取TNBP标准工作液10 µL置于该管中，按2.3.1项下自“精密加内标工作液50 µL与1.5 moL/L高氯酸溶液0.75 mL”起同法操作。

结果见图1，未经病毒灭活处理的降纤酶及样品处理所用试剂在TPP、TNBP保留时间范围内无杂质峰；TNBP和TPP达基线分离，分离度达3.0以上，TNBP峰理论板数在9000以上。

2.5线性关系考察：分别精密吸取TNBP标准工作液10、20、40、60、80 µL，分别置已精密加入3 mL水的5支具塞玻璃离心管中，然后分别精密加内标工作液50 µL，按2.3.1项下自“振荡1 min”起同法操作.以各TNBP对照品峰面积与TPP内标峰面积比（Y）对TNBP对照品溶液浓度（X）作直线回归，得直线回归方程：Y=0.1474X+0.067，R=0.9973。线性范围为2～16 µg/mL。

2.6精密度试验：精密吸取TNBP标准工作液10 µL置加有3 mL蒸馏水的具塞玻璃离心管中，然后分别加入内标工作液50 µL，按2.3.1项下自“振荡1 min”起同法操作，连续进样6次，计算磷酸三丁酯峰面积与磷酸三丙酯峰面积之比值的相对标准偏差（RSD）。结果RSD为2.6%（n=6）。

2.7稳定性试验：取2.6项下制作的溶液，分别在0、4、8 h测定。三次测定值基本不变，RSD为1.03%（n=3）。

2.8加样回收试验：精密量取没有经S/D法进行病毒灭活的降纤酶溶液适量，用注射用水稀释至每毫升约含降纤酶10单位的溶液，精密量取该溶液3.0 mL，置3支具塞玻璃离心管中，分别加入TNBP标准工作液20 µL、40 µL、60 µL，然后各管加入内标工作液50 µL和1.5 mol/L高氯酸溶液0.75 mL，按照2.3.1项中自“振荡1 min”起同法处理，低、中、高3个浓度的溶液分别连续进样3次，计算加样回收率，分别为：98%、101.3%、100.6%，RSD分别为：1.8%、1.08%、2.51%。

2.9降纤酶原液，中磷酸三丁酯残留量测定：精密量取经病毒灭活处理的降纤酶原液，用注射用水稀释成每毫升约含降纤酶10单位的溶液，按2.3.1项下自“精密量取样品溶液3.0 mL”起同法操作。记录TNBP和TPP的峰面积，用回归方程计算TNBP的残留量，结果在经病毒灭活处理的降纤酶原液中没有检出磷酸三丁酯的残留。经病毒灭活处理的降纤酶原液的色谱图见图2。

3　讨　论

柱层析纯化得到的降纤酶溶液经S/D病毒灭活、超滤去除有机溶剂工序得到降纤酶原液，每毫升降纤酶原液降纤酶含量在200单位以上，蛋白浓度在0.15 mg/mL以上；在2.4项样品溶液的制备过程中，加入正己烷4 mL，振荡2 min后乳化严重，乳化程度随供试品溶液浓度的增加而增加，离心（3000 rpm） 20 min后乳化仍未完全破除，在振荡器上振摇、再离心效果甚微，仅能吸取少量的上层正己烷溶液，不易按药典［8］方法将上层正己烷溶液全部取出并用空气流浓缩至0.2mL。本研究对样品溶液的前处理工序进行简化，没有用空气流将正己烷浓缩，而是吸取上层乳化破除的正己烷溶液直接进样，并适当增大进样量（进样量由药典［8］方法中的0.1 µL提高到1 µL），同样取得良好的测定结果。

［1］汤圣希，舒雨雁.蛇毒降纤酶的主要药理作用［J］.蛇志，1999，11（3）: 1-3.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版二部［S］.北京:中国医药科技出版社，凡例XIV.

［3］国家食品药品监督管理局.多组分生化药注射剂基本技术要求（试行）［S］.国食药监注［2008］7号发布.

［4］王剑锋，英志芳，李长贵，等.S/D法灭活血液制剂中脂包膜病毒效果验证的研究［J］.微生物学免疫学进展，2008，36（3）:38-41.

［5］赵宜为，常娅莉，王巍，等.S/D灭活血浆内脂包膜病毒及病毒灭活血浆的研究［J］.微生物学免疫学进展，2004，32（l） :17-19.

［6］Piët MP1，Chin S，Prince AM，et al.The use of tri（n-butyl）phosphate detergent mixtures to inactivate hepatitis viruses and human immunodeficiency virus in plasma and plasma's subsequent fractionation［J］.Transfusion，1990，30（7）:591-598.

［7］国家食品药品监督管理局药品认证中心.ICH质量管理文件汇编［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:81-95.

［8］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版三部［S］.北京:中国医药科技出版社，附录38.

Determination of Residue tri（n-butyl） Phosphate in the Original Solution of Defibrase

YUAN Cai-jun1，ZHU Tian-xin2
（1 Department of Pharmacy，Zhumadian Central Hospital，Zhumadian 463000，China；2 Xintai Pharmaceutical Co.ltd，Zhumadian 463000，China）

Objective To establish a capillary gas chromatography （GC） for the determination of residue tri（n-butyl） phosphate （TNBP） in the original solution of defibrase. Methods Using tripropyl phosphate （TPP） as internal standard，a simple capillary GC method was developed with a AT-FFAP capillary column （30 m×0.32 µm×0.25 mm）；the injection port temperature was 190 ℃；the detector temperature was 210 ℃；column temperature was 140 ℃；the carries gas was high purity nitrogen. Results The linear range of TNBP was 2-16 µg/mL（r=0.9973）. At low，medium and high concentrations，the recovery of TNBP was 98%，101.3%，100.6% respectively，and the RSD was 1.8%，1.08% and 2.51% （n=3） respectively. Conclusion The methods is simple，precise and accurate，and can be used to determine residue of TNBP in the original solution of defibrase.

Defibrase；Tri（n-butyl） phosphate（TNBP）；Residue；Gas chromatography；Assay

R9

B

1671-8194（2015）22-0056-02