杨梅叶原花色素对猪油抗氧化作用的研究

潘俊娴，李　昕，陈士国，叶兴乾（浙江大学生物系统工程与食品科学学院，馥莉食品研究院，浙江省农产品加工技术研究重点实验室，浙江省食品加工技术与装备工程中心，浙江杭州310058）

杨梅叶原花色素对猪油抗氧化作用的研究

潘俊娴，李昕，陈士国，叶兴乾*
（浙江大学生物系统工程与食品科学学院，馥莉食品研究院，浙江省农产品加工技术研究重点实验室，浙江省食品加工技术与装备工程中心，浙江杭州310058）

以过氧化值（POV）、酸价（AV）、丙二醛含量为指标，采用Schaal烘箱法研究了杨梅叶原花色素对猪油的抗氧化作用，并用食品氧化稳定性测定仪测定氧化诱导期（IP）。结果表明：杨梅叶原花色素对猪油过氧化值、酸价、丙二醛含量的升高具有显著的抑制作用（p＜0.05），能抑制猪油的氧化。当杨梅叶原花色素添加量为0.1%时，其对猪油氧化的抑制作用强于BHT，但比TBHQ稍弱，表明杨梅叶原花色素对猪油具有良好的抗氧化效果，能有效延缓猪油的氧化程度。在第14 d时，相比空白组，杨梅叶原花色素添加量为0.1%的处理组对猪油过氧化值、酸价、丙二醛含量的抑制率分别为76%、69%、94%。此外，随着杨梅叶原花色素添加量的增加，猪油的氧化诱导期增加，杨梅叶原花色素添加量达到0.1%时其氧化诱导期和抗氧化系数介于BHT和TBHQ之间，且与BHT无显著性差异（p＞0.05），说明杨梅叶原花色素对猪油具有抗氧化作用。

杨梅叶，原花色素，猪油，抗氧化

食用油脂氧化是油脂及含油脂食品败坏的主要原因之一。油脂的氧化会导致过氧化物、醛、酮等有毒物质的形成，不良风味的产生，从而使食品的品质、营养价值快速下降，限制了油脂的长期使用［1］。食用油脂氧化会导致肿瘤、动脉粥样硬化等疾病，并加速人体老化。因此，保证食用油质量安全、防止油脂发生氧化酸败成为油脂生产、贮存的关键环节。目前延缓油脂氧化最有效的措施就是添加抗氧化剂［1］。目前常用的合成抗氧化剂主要有叔丁基对羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）、没食子酸丙酯（PG）、特丁基对苯二酚（TBHQ）等酚类抗氧化剂，但相关研究表明合成抗氧化剂存在一定的危害性［2］，因此，国内外研究者们努力寻找并开发出天然、高效、无毒的抗氧化剂，用以取代合成抗氧化剂，寻找天然抗氧化剂以替代合成抗氧化剂是目前研究的热点与趋势所在。

原花色素是广泛存在于植物界的多酚类物质，大量研究结果表明其具有抗氧化、抗癌、预防和治疗心血管疾病等作用［3-4］。原花色素抗氧化、清除自由基，主要源于其化学结构中含有的大量酚羟基，可供给自由基以电子，中断自由基反应［3-5］。天然原花色素广泛存在于各种植物中，如花生、葡萄、苹果、茶叶、可可、大麦等中。杨梅叶中也富含原花色素［6］，杨梅叶原花色素（PCBLs）为原飞燕草素，其结构组成单元几乎全部为EGCG［7］。研究表明杨梅叶提取物具有抗氧化、抗菌、抗病毒的作用［3］。目前对于杨梅叶的研究主要集中于其中提取得到的杨梅酮的功效利用，如镇痛和抗炎作用，但对于杨梅叶原花色素的研究较少［5］。

评价油脂氧化稳定性的方法包括烘箱法（Schaal法）、活性氧法（AOM法）、氧化稳定仪法（Rancimat法）等［8］。本文采用Schaal烘箱法和Rancimat法相结合研究从杨梅叶中提取分离得到的原花色素对猪油的抗氧化性能，并与常用抗氧化剂如BHT、TBHQ进行对比，以期为杨梅叶原花色素在食品中的实际应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

杨梅叶采自浙江慈溪；猪板油市售；二丁基羟基甲苯（BHT）、特丁基对苯二酚（TBHQ） 国药集团化学试剂有限公司；盐酸、过氧化氢、三氯甲烷、甲醇、氯化亚铁、硫氰酸钾、乙醚、乙醇、氢氧化钾、硫代巴比妥酸、三氯乙酸等均为分析纯。

UV2550型紫外分光光度计日本Shimadzu公司；743Rancimat食品氧化稳定性测定仪瑞士Metrohm公司；DKS-12型电热恒温水浴锅嘉兴市中新医疗仪器有限公司；PH070A型恒温干燥箱上海一恒科技有限公司；Solarus数字滴定仪德国赫施曼；THZ-82型水浴恒温振荡器江苏金坛亿通电子有限公司；JA1003N型电子天平上海菁海仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1杨梅叶原花色素的提取杨梅叶原花色素的提取与纯化参照之前实验室的方法［3］。新鲜杨梅叶置于40℃干燥后粉粹，过20目筛子，将粉末置于70%（v/v）的丙酮水溶液中，室温浸提三次。收集合并三次提取液，40℃旋转蒸发除去丙酮，趁热过滤，得到水溶液，依次用正己烷和二氯甲烷萃取，分别萃取三次，以除去低极性物质。萃取所得的水相旋转蒸发除去有机溶剂并浓缩后冷冻干燥，得到杨梅叶原花色素粗提物，提取率约为10%，粗提物经大孔树脂纯化后得到杨梅叶原花色素。

1.2.2样品处理猪油的制备：将市购猪板油清洗干净后，切成小块状，在100～130℃的温度下熬制，趁热用纱布滤去油渣，冷却后用保鲜膜封口，放置于4℃的冰箱中备用。

1.2.3Schaal烘箱法以猪油作为底物，加入杨梅叶原花色素，用1 mL 95%乙醇溶解。杨梅叶原花色素添加量分别为0.02%和0.1%。采用Schaal烘箱法即将处理样置于（70±1）℃的恒温干燥箱中保存，每隔24 h搅拌2 min，并调整它们在恒温箱中的位置，分别在第0、2、4、6、8、10、12、14 d测定。空白为1 mL 95%乙醇，并以0.02%BHT、0.02%TBHQ作为阳性对照。参照食用动物油脂卫生标准（GB10146-2005），当酸价（AV）≥1.5 mg/g，过氧化值（POV）≥16 meq/kg，丙二醛≥0.25 mg/100g时终止实验。

1.2.3.1过氧化值（POV）的测定参照国标（GB10146-2005，GB/T 5009.37-2003）测定。精密称取约0.01～1.0 g试样于10 mL容量瓶内，加三氯甲烷+甲醇（7+3）混合溶剂溶解并稀释至刻度，混匀。精密吸取1.0 mL试样溶液于干燥的10 mL比色管内，加1滴（约0.05 mL）氯化亚铁（3.5 g/L）溶液，用三氯甲烷+甲醇（7+3）混合溶剂稀释至刻度，混匀。加1滴（约0.05 mL）硫氰酸钾溶液（300 g/L），混匀。室温（10～35℃）下准确放置5 min后，于波长500 nm处测定吸光度。

1.2.3.2酸价（AV）的测定参照国标（GB10146-2005，GB/T 5009.37-2003）测定。称取3 g混匀的试样，置于锥形瓶中，加入50 mL中性乙醚-乙醇混合液，振摇使油溶解，必要时可置热水中，温热促其溶解。冷却至室温，以酚酞为指示剂，以氢氧化钾标准滴定溶液（0.050 mol/L）滴定，至初现微红色，且0.5 min内不褪色为终点。

1.2.3.3丙二醛的测定参照国标（GB/T 8937-2006）测定。准确称取在70℃水浴上融化均匀的猪油液10 g，置于100 mL有盖三角瓶内，加入50 mL三氯乙酸混合液，振摇30 min过滤。准确移取上述滤液5 mL，加入5 mL TBA溶液，100℃沸水浴中保持30 min，取出后用流动自来水冷却10 min，于波长532 nm处测定吸光度。

1.2.3.4总氧化值（TOTOX）的测定通常，总氧化值根据2 POV+茴香胺值计算得到。因为，茴香胺值和丙二醛均为计算油脂次级氧化产物的程度，丙二醛值能替代茴香胺值来评估总氧化值（TOTOXTBA=2 POV+ TBARS）［9］。

1.2.4Rancimat法诱导期（Induction period，IP）是从开始测定至形成的氧化产物开始快速增加的时间，Rancimat通过测定电导率的变化，以反应起始到劣变转折点的时间来表示氧化诱导期。通过Rancimat法测定添加不同样品猪油的氧化诱导期。将杨梅叶原花色素用1 mL 95%乙醇溶解，以一定比例添加到猪油中，并以0.02%BHT、0.02%TBHQ作阳性对照，称取3.00 g油样于玻璃管中，用Rancimat进行氧化稳定性测试，加热温度130℃，进气流量20 L/h［10］。每个样品做三个平行实验。

采用抗氧化系数（Protection factor，Pf）来确定抗氧化剂的抗氧化性能，定义为加入抗氧化剂后的IP值除以未加入抗氧化剂（空白）的IP值。Pf值越大，则抗氧化剂的作用越强［11］。Pf＜1，表明该物质有催化抗氧化活性；Pf=1，表明该物质既无抗氧化活性也无催化氧化活性；1＜Pf≤2，表明该抗氧化剂有抗氧化活性；2＜Pf≤3，表明该抗氧化剂有明显的抗氧化活性；Pf＞3，表明该抗氧化剂有很强的抗氧化活性［12］。

1.2.5数据分析每个样品设3个平行，采用Origin 8.0和SPSS 20.0软件进行数据分析。测定结果以平均值±标准差表示。实验数据采用ANOVA进行邓肯氏（Duncan’s）差异分析，以p＜0.05为差异显著。

2　结果与分析

2.1Schaal烘箱法

2.1.1杨梅叶原花色素对猪油过氧化值的影响氢过氧化物是油脂氧化的主要初级产物，在油脂氧化初期，过氧化值随氧化程度加深而增高。杨梅叶原花色素对猪油过氧化值的影响如图1所示。结果显示，在猪油的放置过程中，随着天数的增加，过氧化值不断升高，且上升速度越来越快，说明在（70±1）℃贮藏温度下，随着时间的增加，猪油氧化酸败的程度增加，其中空白组过氧化值上升速率最快。但添加了杨梅叶原花色素、BHT、TBHQ的猪油其过氧化值上升趋势较空白明显降低，表明杨梅叶原花色素对猪油过氧化值的升高有一定的抑制作用，且随剂量增加抑制作用增强。添加量为0.02%的杨梅叶原花色素抑制过氧化值升高的效果与BHT相当。而添加0.1%的杨梅叶原花色素的抑制作用强于BHT，但比TBHQ弱。在第14 d时，相比空白组，添加0.02%和0.1%杨梅叶原花色素对猪油过氧化值的抑制率分别达到34%和76%，并存在显著性差异（p＜0.05）。表明杨梅叶原花色素可作为猪油的抗氧化剂，来延缓猪油的氧化。

图1　不同样品对猪油过氧化值的影响Fig.1　Effect of different samples on the peroxide value of lard oil

2.1.2杨梅叶原花色素对猪油酸价的影响酸价是检验油脂质量的重要指标，随着储藏期的延长和油脂的酸败，酸价也呈现上升的趋势。从图2中可以看出，在70℃条件下，随着时间的延长，酸价会不断上升，说明脂肪氧化程度随着天数而加深。在前6 d，各处理组的酸价与空白对照组差异并不显著（p＞0.05），之后空白组酸价开始明显上升，而添加了杨梅叶原花色素、BHT、TBHQ后，其酸价较空白组上升的速度明显降低。杨梅叶原花色素抑制酸价上升的能力随添加剂量的增大而增大，但添加剂量为0.02%和0.1%时的抑制效果均弱于BHT和TBHQ，相比空白具有显著性差异（p＜0.05）。表明杨梅叶原花色素对猪油酸价具有较好的抑制作用。

图2　不同样品对猪油酸价的影响Fig.2　Effect of different samples on the acid value of lard oil

2.1.3杨梅叶原花色素对猪油丙二醛含量的影响油脂氧化初级产物氢过氧化物不稳定，易进一步发生分解和聚合，丙二醛就是分解产物的一种。不同样品对丙二醛含量的影响如图3所示。由图3可知，随着时间的延长，猪油丙二醛含量不断上升，在第0～2 d时，各处理组的丙二醛含量与空白组并无显著性差异（p＞0.05），这是因为此阶段为生成初级氧化产物阶段，而其分解速度较慢，次级氧化产物相对较少。之后，随着时间的延长，空白组丙二醛含量上升，在第8 d时，其丙二醛值已接近食用动物油脂卫生标准（GB10146-2005）的上限（丙二醛≤2.5 mg/kg）。添加了0.1%杨梅叶原花色素的猪油，其丙二醛含量无明显上升，与BHT、TBHQ组相当，无显著性差异（p＞0.05），与空白相比具有显著性差异（p＜0.05）。但添加了0.02%杨梅叶原花色素的猪油在前6 d对丙二醛含量有较好的抑制作用，第6 d后丙二醛含量明显上升，第12 d其丙二醛含量接近于空白。说明添加量为0.1%杨梅叶原花色素在贮藏期间对猪油丙二醛含量具有很好的抑制作用。

图3　不同样品对猪油丙二醛含量的影响Fig.3　Effect of different samples on the content of malondialdehyde of lard oil

2.1.4杨梅叶原花色素对猪油总氧化值的影响过氧化值是不饱和脂肪酸中的双键与空气中的氧结合生成产物的量化指标，反映脂质发生初级氧化的程度。丙二醛值是指油脂中不饱和脂肪酸氧化分解所产生的次级产物如丙二醛等与TBA反应的结果，表明脂质次级氧化的程度。因此，可通过过氧化值和丙二醛值来评估总氧化值（TOTOXTBA=2 POV+TBARS），反应油脂总体氧化程度。

由图4可知，随着时间的增加，总氧化值呈现上升趋势，且各处理组总氧化值均低于空白组，添加了杨梅叶原花色素的猪油其总氧化值上升趋势较空白明显降低。添加量为0.02%的杨梅叶原花色素抑制总氧化值升高的效果与BHT相当，而添加量0.1%的杨梅叶原花色素的抑制作用强于BHT，但比TBHQ弱。在第14 d时，总氧化值的大小分别是空白＞0.02%杨梅叶原花色素＞0.02%BHT＞0.1%杨梅叶原花色素＞0.02%TBHQ，且与空白组相比，杨梅叶原花色素能显著性抑制总氧化值的升高（p＜0.05）。说明杨梅叶原花色素能较好地抑制猪油的氧化程度。

图4　不同样品对猪油总氧化值的影响Fig.4　Effect of different samples on the total oxidation value of lard oil

2.2Rancimat法

氧化诱导期越大，说明抗氧化剂的作用越强。由图5可知，在130℃下，添加了杨梅叶原花色素的样品，氧化诱导期明显比空白猪油样品大，这说明杨梅叶原花色素能有效抑制猪油氧化，延长猪油的货架期。同时，随着杨梅叶原花色素添加量的增加，其诱导时间增长，这表明提取物添加量与其抗氧化活性之间存在量效关系。杨梅叶原花色素添加量0.1%的猪油其氧化诱导期介于BHT与TBHQ之间，且与BHT无显著性差异（p＞0.05）。

图5　不同样品对猪油氧化诱导期的影响Fig.5　Effect of different samples on the induction period oflard oil

根据抗氧化系数分析，Pf值越大，则抗氧化剂的作用越强，由图6可知，添加了样品的猪油其Pf值均大于1，说明添加剂均起到了抗氧化作用。杨梅叶原花色素添加量为0.02%时1＜Pf≤2，表明其具有抗氧化活性；添加BHT的猪油，2＜Pf≤3，表明BHT有明显的抗氧化活性；添加0.1%杨梅叶原花色素及TBHQ的猪油，Pf＞3，表明该抗氧化剂有很强的抗氧化活性。其中，杨梅叶原花色素添加量达到0.1%时，其抗氧化系数与BHT相当，且无显著性差异（p＞0.05）。

图6　不同样品对猪油抗氧化系数的影响Fig.6　Effect of different samples on the oxidation protection factor of lard oil

研究表明酚类化合物通过清除自由基，螯合金属离子，起到抗氧化作用［15］。原花色素作为一种酚类物质，具有很强的抗氧化活性。葡萄籽原花青素在亚油酸及脂质体体系中，其活性高于VC和VE，原花青素主要通过链阻断机理抗脂质过氧化，另外，原花青素对油脂中Cu2+的螯合作用也有助于延缓脂质过氧化作用［14］。杨梅叶原花色素完全为原飞燕草素，其结构组成单元几乎全部为EGCG［7］，而油脂氧化反应是一种自由基链式反应，因此，杨梅叶原花色素对油脂的抗氧化作用，主要源于EGCG结构中含有的大量酚羟基，可供给自由基以电子，中断自由基反应，从而能够起到延缓油脂氧化的作用。杨梅叶原花色素清除自由基能力随着酚羟基的增多而增大［13］。凌智群等［16］研究了莲房原花青素在脂质体系中的抗氧化作用，结果表明其对猪油和豆油具有抗氧化活性。禹华娟等［17］通过添加不同浓度原花青素以及与卵磷脂等抗氧化剂复配，应用于动植物油脂中，也研究了莲原花青素在油脂体系中的抗氧化作用，结果表明原花青素对油脂氧化抑制效果显著，且对不同油脂的抗氧化效果具有差异。杨梅叶原花色素加入到猪油中能抑制过氧化值、酸价、丙二醛的升高，明显延长猪油的诱导时间，而且增大杨梅叶原花色素的添加量，可明显增大油脂的氧化稳定值，即延长油脂货架期，说明杨梅叶原花色素对猪油具有良好的抗氧化作用。

3　结论

根据Schaal实验，可知添加杨梅叶原花色素对猪油过氧化值、酸价、丙二醛含量、总氧化值的升高均起到抑制作用，能延缓猪油的氧化。当添加0.1%的杨梅叶原花色素对猪油氧化的抑制作用强于BHT，但比TBHQ稍弱。在第14 d时，相比空白组，杨梅叶原花色素添加量为0.1%的处理组对猪油过氧化值、酸价、丙二醛含量的抑制率分别为76%、69%、94%。由Rancimat测定猪油的氧化诱导期，杨梅叶原花色素加入到猪油中能明显延长猪油氧化诱导期，而且随着杨梅叶原花色素添加量的增加，猪油的氧化诱导期增加，杨梅叶原花色素添加量0.1%的猪油其氧化诱导期介于BHT与TBHQ之间，且与BHT无显著性差异（p＞0.05），说明杨梅叶原花色素对猪油具有良好的抗氧化作用。杨梅叶作为一种废弃物，从其中提取得到的原花色素，安全性高，将其开发成为一种天然抗氧化剂具有实际应用价值。

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Antioxidant activities of proanthocyanidins from Chinese bayberry（Myrica rubra Sieb.et Zucc.）leaves in lard oil

PAN Jun-xian，LI Xin，CHEN Shi-guo，YE Xing-qian*
（Zhejiang University，College of Biosystems Engineering and Food Science，Fuli Institute of Food Science，Zhejiang Key Laboratory for Agro-Food Processing，Zhejiang R&D Center for Food Technology and Equipment，Hangzhou 310058，China）

The antioxidant activities of proanthocyanidins from Chinese bayberry leaves in lard oil was studied using peroxide value（POV），acid value（AV）and the content of malondialdehyde by Schaal oven-storage test. Induction period was determined by oxidative stability instrument.The results showed that proanthocyanidins from Chinese bayberry leaves had significant inhibitory effect on the POV，AV and the content of malondialdehyde（p＜0.05）and could inhibit the oxidation of lard oil.When adding 0.1%proanthocyanidins from Chinese bayberry leaves into the lard oil，the inhibition of oxidation was better than BHT，while was worse than TBHQ，indicating proanthocyanidins from Chinese bayberry leaves had powerful antioxidant activity in lard oil and could prevent the oxidation of oil effectively.Inhibition rates of POV，AV and the content of malondialdehyde were 76%，69%and 94%for proanthocyanidins treatment group of 0.1%in the 14th day.Moreover，with the increasing of additive amount of proanthocyanidins from Chinese bayberry leaves，the induction period of lard oil was increasing.When the additive amount was 0.1%，the induction period and oxidation protection factor were between that of BHT and TBHQ and there were no significant difference with BHT（p＞0.05），showing that proanthocyanidins from Chinese bayberry leaves had antioxidant activity in lard oil.

Chinese bayberry leaves；proanthocyanidins；lard oil；antioxidant activities

TS255.1

A

1002-0306（2015）20-0111-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.014

2015－02－05

潘俊娴（1991-），女，硕士研究生，研究方向：果蔬加工，E-mail：xianzizmcx@163.com。

叶兴乾（1962-），男，教授，研究方向：果蔬加工与工程，E-mail：psu@zju.edu.cn。

国家科技支撑项目（2012BAD31B06）；浙江省科技特派员专项（团队项目）（2012T2T123）。