荔枝果肉苯丙氨酸解氨酶特性的研究

薛楚然，刘树文，*，卜　潇，严　俊，徐向文（.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌700；.广东为多生物科技有限公司，广东茂名55000）

荔枝果肉苯丙氨酸解氨酶特性的研究

薛楚然1，刘树文1，*，卜潇1，严俊1，徐向文2
（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌712100；2.广东为多生物科技有限公司，广东茂名525000）

研究了荔枝果肉中苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL）的酶学特性。荔枝PAL动力学曲线并不遵循米氏方程，其最适底物浓度为2 mmol/L。在硼砂-硼酸缓冲液中，荔枝PAL的最适反应pH为8.7。PAL不耐酸碱，尤其不耐酸。荔枝PAL的最适反应温度为45℃，高于75℃则易于钝化，具有较强的耐热性。L-酪氨酸和L-半胱氨酸对荔枝PAL均有明显的抑制作用；金属离子中，Fe2+和Fe3+对荔枝PAL活性具有明显的促进作用，而Ca2+、Cu2+、Co2+、Ag+离子则对其活性有明显的抑制作用。

荔枝，苯丙氨酸解氨酶（PAL），酶学特性

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）为我国亚热带地区的特有水果，因其具有丰富的营养价值和独特而优雅的风味，独享“果中之王”的称号。然而，荔枝在储藏和加工过程中极易出现褐变现象，使得产品的品质和营养成分受到损失。导致荔枝及其产品褐变的主要原因是参与氧化反应的各类酶，如多酚氧化酶、过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶等［1-2］。目前已有许多探究荔枝果肉多酚氧化酶、过氧化物酶的酶学性质的研究［3-4］，然而荔枝果肉中苯丙氨酸解氨酶的性质研究仍是空白。

苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonialyase，PAL；EC 4.3.1.5）催化直接脱掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式肉桂酸，是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，也是苯丙烷类代谢途径中研究最多的酶。PAL与一些重要的次生物质如木质素、黄酮类物质的合成有关，为多种酚类及类黄酮终产物提供前体［5-6］。由于苯丙氨酸解氨酶与酚类物质的合成紧密相关，因而也是影响荔枝及其加工产品酶促褐变的重要因素。本文通过对荔枝果肉苯丙氨酸解氨酶（PAL）进行提取并研究其相关酶学性质，为荔枝酶促褐变机理研究提供一定的理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

荔枝2014年6月采摘于广东省茂名市，品种黑叶；L-苯丙氨酸梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，HPLC 98%；EDTA-Na2上海正极生物科技有限公司，分析纯；β-巯基乙醇行知生物科技有限公司；硼砂、硼酸上海江莱生物科技有限公司，分析纯；L-酪氨酸、L-半胱氨酸北京达科为生物技术有限公司HPLC 98%。

UV-2450 SPECTROPHOTOMETER型紫外分光光度计日本SHIMADZU公司；Sorvall RC5C Plus型冷冻高速离心机美国Thermo Scientific公司；AUY220型电子分析天平日本SHIMADZU公司；

1.2实验方法

1.2.1原料预处理取成熟度适中，果实饱满且无病害的荔枝果实为原料。将果实去皮、去核，于-20℃下冷冻保存。

1.2.2荔枝PAL酶液的提取参照Koukol等［7］的方法加以修改。取50 g冷冻保存的荔枝果肉，分两次加入共50 mL预冷的硼砂-硼酸缓冲液（0.2 mol/L硼酸根，pH8.7，含1 mmol/L EDTA，20 mmol/L β-巯基乙醇），加入石英砂，冰浴研磨。将研磨而成的匀浆经4层纱布过滤，滤液4℃，12000 r/min离心20 min，上清液即为酶粗提液，4℃下保存备用。

1.2.3荔枝PAL活性的测定参照Koukol［7］和Solecka等［8］的方法，略加修改。在10 mL反应体系中，包含pH8.7硼砂-硼酸缓冲液、底物L-苯丙氨酸和PAL粗酶液（各成分的具体体积因不同实验因素而异，见下文），并平均分为两份。一份在加入PAL酶液后立即以200 μL HC1溶液（6 mol/L）终止反应，另一份于45℃保温60 min后，以200μL HC1溶液（6 mol/L）终止反应，分别测定两份反应溶液在290 nm处光吸收值，即A290nm。以不加L-苯丙氨酸的反应体系（以蒸馏水替代）为参比，并以加入酶液煮沸后来验证反应是由酶液引起的。以每小时生成的肉桂酸的量来表示酶活性。以反应体系每小时A290nm增加0.01为一个酶活性单位（U），PAL活性按以下公式计算后，单位为U·g-1·h-1：

在这种社会中，个体显然无法凭自己的才智和机会满足需求、实现价值。然而，追求满足的本能冲动之火永不熄灭，只好随波逐流，处心积虑构建自己的关系网、人际圈。整个社会因此陷入一种恶性循环，成为一种可怕的“大染缸”、“大酱缸”。［17］在当下中国，如果“熟人社会”任其过分发育和延伸，必然导致对法制社会的腐蚀、市场经济的摧残、和谐社会的瓦解。所以，我们应当而且必须要实现从“熟人社会”向“陌生人社会”的转型。

式中，Vt：酶液总体积（mL）；W：样品鲜重（g）；Vs：测定时取酶液的量（mL）；v：反应液总体积（mL）；t：反应时间（h）。

1.2.4底物浓度对荔枝PAL活性的影响10 mL反应体系中，分别加入硼砂-硼酸缓冲液（pH8.7）8.95、8.9、8.8、8.6、8.2、7.4、5.8 mL，各加PAL酶液1 mL，再分别加L-苯丙氨酸溶液（0.1 mol/L）0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL，使底物终浓度分别为0.5、1、2、4、8、16、32 mmol/L。将反应体系置于45℃保温60 min，测定290 nm处光吸收值。

1.2.5酶液体积分数对荔枝PAL活性的影响10 mL反应体系中，分别加入硼砂-硼酸缓冲液（pH8.7）8.8、8.4、8.0、7.6、7.2、6.8、6.4、6.0、5.6 mL，各加L-苯丙氨酸溶液（0.1 mol/L）1 mL，再依次加入PAL酶液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0、3.4 mL，使体系中酶液体积分数分别为2%、6%、10%、14%、18%、22%、26%、30%、34%。将反应体系置于45℃保温60 min，测定290 nm处光吸收值。

1.2.6pH对荔枝PAL活性的影响取pH为7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.7、9.0的硼砂-硼酸缓冲液8.9 mL，各加入L-苯丙氨酸溶液（0.1 mol/L）0.1 mL和PAL酶液1 mL，45℃保温60 min，测定290 nm处光吸收值。另外将酶液置于pH4.0（磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液）、pH6.0（磷酸缓冲液）、pH10.0（硼砂-氢氧化钠缓冲液）缓冲体系中保温5、10、20、30、60 min后，按照1.2.3所述方法测定PAL活性。

1.2.7温度对荔枝PAL活性的影响将反应体系（pH8.7硼砂-硼酸缓冲液8.9 mL，L-苯丙氨酸溶液0.1 mL，PAL酶液1 mL）分别置于25、35、45、55、65、75、85、100℃温度下保温60 min，测定290 nm处光吸收值。将酶液分别置于25、35、45、55、65、75、85、100℃温度下分别保温5、10、20、30 min后取出，按照1.2.3所述方法测定PAL活性。

1.2.8氨基酸和金属离子对荔枝PAL活性的影响将反应体系（pH8.7硼砂-硼酸缓冲液8.9 mL，L-苯丙氨酸溶液0.1 mL，PAL酶液1 mL）中分别加入不同浓度的L-酪氨酸、L-半胱氨酸，或分别加入2 mmol/L的金属离子（Na+，Mg2+，Ca2+，Cu2+，Fe3+，Fe2+，Co2+，Mn2+，Ag+，Zn2+等），45℃保温60 min，测定290 nm处光吸收值。1.2.9数据处理本文中所有实验均进行三次重复，实验结果利用SPSS 19.0软件进行分析；利用Origin 8.5作图软件进行作图。

2　结果与分析

如图1所示，随着底物浓度的升高，荔枝PAL活性呈先上升后下降的趋势，并在底物浓度为2 mmol/L时达到最大值。有研究表明，大多数生物的PAL动力学曲线并不遵循米氏方程，但也有个别生物如粘红酵母的L-PAL在底物为NH4+时的酶促反应符合经典的米氏方程［9-10］。本研究表明，荔枝PAL动力学曲线同样不遵循米氏方程，当底物浓度高于2 mmol/L时将抑制酶活性，这与江力等［11］对山药PAL性质的研究结果相似。目前已纯化分离的多数植物中PAL的Km值在0.3×10-4～1.5×10-2mol/L［12］，有一些植物则具有两个Km值，如小麦和油菜等［13-14］。

图1　底物浓度对荔枝PAL活性的影响Fig.1　The effect of substrate concentration on the activity of Litchi PAL

2.2酶液体积分数荔枝PAL活性的影响

本研究中，以10 mL反应体系中所含荔枝PAL酶提取液的体积分数表示酶浓度。如图2所示，随着反应体系中PAL酶液体积分数的增加，PAL活性也随之上升。当体积分数小于26%时，其活性增加的速度较快，而当大于26%后，则活性增加的趋势渐缓。这主要是由于底物含量一定的情况下，酶量增大到一定值后活性便不再升高。

图2　酶液体积分数对荔枝PAL活性的影响Fig.2　The effect of enzyme volume fraction on the activity of Litchi PAL

2.3荔枝PAL最适pH及pH适应性

由图3可以看出，从pH7.4～8.2，荔枝PAL的活性处于上升趋势，并于pH8.2时达到第一个最大值。pH8.4时，PAL活性降低，并在pH8.7时达到第二个最大值。这种趋势可能是由于在荔枝果肉中存在苯丙氨酸解氨酶的同工酶。不同来源的PAL最适pH在8.0～9.5之间，如红酵母和鹰嘴豆的最适pH分别为8.5［13］和9.4［15］，而小麦和水稻的最适pH分别为8.8和9.2［12］。

图3　荔枝PAL的最适反应pHFig.3　The optimum pH value for Litchi PAL

如图4所示，荔枝果肉PAL不耐酸碱。在pH4.0时，水浴5 min后PAL活性则降低至45%，而水浴60 min后几乎丧失全部活性；pH6.0时，水浴5 min后PAL活性仍保持67%左右，30 min后活性降低至27%，而60 min后活性低于20%；在碱性条件下（pH10.0），荔枝PAL活性始终高于酸性条件，在水浴10min后仍具有66%的活性，但60 min后活性降低至15%左右，与pH6.0下水浴60 min后得到的活性相近。pH对PAL有两方面的影响：一方面过酸或过碱改变酶的空间构象，使酶失活；另一方面pH改变底物的解离状态，影响它与酶的结合，从而影响酶催化的效率。从图4可知，荔枝PAL在pH4.0、6.0、10.0的条件下水浴保温5 min后，即使将反应pH恢复至最适值，酶活性均有所降低。说明酸碱环境可使荔枝PAL的空间构象改变，导致酶失活。因此，在荔枝产品的保藏保鲜过程中，可以通过添加食用酸等食品添加剂来改变环境pH，抑制PAL活性，从而减少褐变的产生。

图4　荔枝PAL对pH的稳定性Fig.4　The stability of Litchi PAL on different pH values

2.4荔枝PAL最适反应温度及温度适应性

如图5所示，在25～100℃的温度范围内，荔枝PAL的最适反应温度为45℃，高于或低于该温度均可使酶活降低。图6显示了荔枝PAL对不同温度的适应性。可以看出，在25～55℃的温度范围内，PAL活性基本没有受到抑制，在55℃下水浴30 min后，其活性仍保持在80%左右。而从65℃开始，荔枝PAL活性受到明显抑制，在65～100℃水浴30 min后，酶活性分别剩余53%、30%、13%和6%。荔枝PAL在高温下仍保留了一定的活性，说明其具有较强的耐热性，但温度高于75℃时荔枝PAL容易钝化。有研究表明，百合鳞茎PAL在80℃水浴5 min后仍有大于80%的活性［16］，甘蓝型油菜PAL在70℃保温5 min后仍有70%左右的活性［14］。而本研究中，在85℃和100℃水浴5 min后，荔枝PAL残余活性分别为43%和30%，耐热性较高。

图5　荔枝PAL的最适反应温度Fig.5　The optimum temperature for Litchi PAL

图6　荔枝PAL对温度的稳定性Fig.6　The stability of Litchi PAL on different temperature

2.5氨基酸和金属离子对荔枝PAL活性的影响

L-酪氨酸和L-半胱氨酸均对荔枝PAL的活性具有明显的抑制作用，且抑制作用随氨基酸浓度增大而增强（图7和图8）。在供试范围内，L-酪氨酸和L-半胱氨酸分别在浓度为1.0 mmol/L和12 mmol/L时，对荔枝PAL活性具有最强的抑制效果。有报道指出，L-酪氨酸和L-半胱氨酸分别是苯丙氨酸解氨酶的竞争性抑制剂和硫氢基类抑制剂。前者的抑制作用机理是与底物竞争苯丙氨酸解氨酶的结合能力［17］，而后者的作用机理可能是对脱氢丙氨酰残基的修饰，这种抑制作用与酶活性部位脱氢丙氨酰基的丧失和减少相伴随。

图7　L-酪氨酸对荔枝PAL活性的影响Fig.7　The effect of L-Tyrosine on the activity of Litchi PAL

图8　L-半胱氨酸对荔枝PAL活性的影响Fig.8　The effect of L-Cysteine on the activity of Litchi PAL

固定浓度下（2 mmol/L），金属离子对荔枝PAL活性的影响差异明显（图9）。Na+、Fe2+和Fe3+促进了酶的活性，其中Fe3+离子的促进效果最明显（159.43%）。其余金属离子均对荔枝PAL有抑制作用，其中Ag+离子的抑制效果最强（PAL相对活性9.32%）。Mg2+离子对于荔枝PAL的活性有微弱的抑制作用，但对于红酵母却有一定的促进作用［13］。

图9　金属离子对荔枝PAL活性的影响Fig.9　The effect of different ion on the activity of Litchi PAL

3　结论

荔枝果肉苯丙氨酸解氨酶（PAL）最适底物浓度为2 mmol/L，荔枝PAL活性随着反应体系中酶液体积分数的增加而呈线性增大。荔枝PAL的最适反应pH为8.7，且pH为8.2时其活性也处于高峰。荔枝PAL不耐酸碱，尤其不耐酸。荔枝PAL的最适反应温度为45℃，在25～55℃温度范围内活性稳定，超过75℃则容易钝化。L-酪氨酸和L-半胱氨酸对于荔枝PAL活性均有明显的抑制作用，在本研究中，二者分别在浓度为1 mmol/L和12 mmol/L时抑制作用最强。金属离子中，Fe2+和Fe3+对荔枝PAL活性具有明显的促进作用，而Ca2+、Cu2+、Co2+、Ag+离子则对其活性有明显的抑制作用。

［1］陈瑞琴，刘宝华，王果，等.不同荔枝品种采后果皮褐变与多酚氧化酶关系的研究［J］.热带作物学报，2012，33（7）：1261-1266.

［2］冯卫华，林丽棉，秦艳，等.荔枝与荔枝酒褐变控制［J］.食品科学，2011，32（4）：246-250.

［3］刘春丽.荔枝果肉过氧化物酶酶学性质研究［J］.西南农业学报，2012，25（2）：424-428.

［4］刘春丽，杨跃寰，陈欲云，等.荔枝果肉多酚氧化酶酶学性质研究［J］.安徽农业科学，2011，39（2）：646-648.

［5］阳光察，薛应龙.植物苯丙烷类代谢的生理意义及其调控［J］.植物生理学通讯，1988，24（3）：9-16.

［6］Ritter H，Schulz GE.Structural basis for the entrance into the phenylpropanoidmetabolismcatalyzedbyphenylalanine ammonia-lyase［J］.The Plant Cell，2004，16（12）：3426-3436.

［7］Koukol J，Conn E E.The metabolism of aromatic compounds in higher plants.Ⅳ.Purification and properties of the phenylalanine deaminase of Herdeum vulagare［J］.Journal of Biology and Chemistry，1961，236：2692-2698.

［8］Solecka D，Kacperska A.Phenylpropanoid deficiency affects the course of plant acclimation to cold［J］.Physiologia Plantarum，2003，119：253-262.

［9］张宽朝，金青，蔡永萍，等.苯丙氨酸解氨酶与其在重要次生代谢产物调控中的作用研究进展［J］.中国农学通报，2008，24（12）：59-62.

［10］Bolwell G P，Bell J N，Cramer C L，et al.L-phenylalanine Ammonia-lyase from Phaseolus vulgaris［J］.European Journal of Biochemistry，1985，149：11.

［11］江力，袁怀波，张世杰，等.山药苯丙氨酸解氨酶特性的研究［J］.食品科学，2006，27（10）：36-40.

［12］江柯，卢涛，赵德立，等.红酵母苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及性质研究［J］.四川大学学报：自然科学版，2004，41（4）：865-868.

［13］欧阳光察，应初衍，沃绍根，等.植物苯丙氨酸解氨酶的研究.Ⅵ.水稻、小麦PAL的纯化及基本特性［J］.植物生理学报，1985，11（2）：204-214.

［14］姜红林，梁颖.甘蓝型油菜苯丙氨酸解氨酶的分离纯化与性质研究［J］.中国农学通报，2006，22（7）：282-286.

［15］孟延发，辛嘉英.植物苯丙氨酸解氨酶的研究：1.鹰嘴豆PAL的纯化及其基本性质［J］.兰州大学学报：自然科学版，1990，26（3）：109-113.

［16］孙红梅，赵爽，王春夏，等.百合鳞茎苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及酶学性质研究［J］.园艺学报，2008，35（11）：1653-1660.

［17］程水源，陈昆松，刘卫红，等.植物苯丙氨酸解氨酶基因的表达调控与研究展望［J］.果树学报，2003，20（5）：351-357.

Study on enzymology properties of L-phenylalanine ammonia-lyase（PAL）in litchi fruit

XUE Chu-ran1，LIU Shu-wen1，*，BU Xiao1，YAN Jun1，XU Xiang-wen2
（1.College of Enology，Northwest A&F University，Yangling 712100，China；2.Guangdong Weiduo Biotechnology Co.，Ltd.，Maoming 525000，China）

The enzymology properties of L-phenylalanine ammonia-lyase（PAL）was investigated in this study. Litchi PAL dynamic curve did not follow the Michaelis-Menten equation.The optimum substrate concentration was 2 mmol/L.In the borax-boric acid buffer，the optimum reaction pH value was 8.7.Litchi PAL did not resistant to acid and alkali，especially to acid.The optimum reaction temperature was 45℃，and if the temperature was higher than 75℃，Litchi PAL was easily passivated.Litchi PAL had strong heat resistance.L-tyrosine and L-cysteine had significant inhibitory effect on Litchi PAL.Among the metal irons，Fe2+and Fe3+had significant promoting effect on PAL，while Ca2+，Cu2+，Co2+and Ag+had significant inhibitory effect on Litchi PAL.

Litchi；L-phenylalanine ammonia-lyase（PAL）；enzymology characteristics

TS201.1

A

1002-0306（2015）20-0206-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.035

2015－03－01

薛楚然（1989-），女，硕士研究生，研究方向：荔枝与荔枝酒褐变机理及其控制，E-mail：xuechuran@hotmail.com。

刘树文（1965-），男，博士，教授，研究方向：葡萄酒酿造工艺、葡萄酿酒微生物，E-mail：liushuwen@nwsuaf.edu.cn。

广东省教育部产学研结合项目资助资金（2011A01003）；茂名市重大科技专项资助资金（2009B090300133）。