Box-Behnken设计-效应面法优化连钱草多糖提取工艺

姜　　宁，刘晓鹏，，*，张俊霞，江亚东，丁振国，李　　力

（1.湖北民族学院生科院，湖北恩施445000；2.南京医药股份股份有限公司，博士后工作站，江苏南京210012；3.南京同仁堂洪泽中药材科技有限公司，江苏洪泽223200）

Box-Behnken设计-效应面法优化连钱草多糖提取工艺

姜宁1，刘晓鹏1，2，*，张俊霞1，江亚东3，丁振国3，李力2

（1.湖北民族学院生科院，湖北恩施445000；2.南京医药股份股份有限公司，博士后工作站，江苏南京210012；3.南京同仁堂洪泽中药材科技有限公司，江苏洪泽223200）

对连钱草多糖进行提取，并通过单因素及响应面实验对提取的四个因素：pH、液固比、提取温度和提取时间进行了优化。结果表明：当提取工艺为pH7.2、液固比33∶1（mL/g）、提取温度89℃、提取时间160min时，多糖提取率最高，可达3.40%±0.05%，与理论值3.39%接近。此研究为连钱草多糖的进一步开发和利用提供了理论依据。

连钱草，Box-Behnken设计，效应面法，多糖，提取

连钱草为唇形科活血丹属植物活血丹［Glechoma longituba（Nakai）Kupr.］干燥地上部分，晒干；或鲜用。连钱草性味凉辛，微苦，微寒。归肝、肾、膀胱经［1］，具有降血糖［2］、利尿利胆［3］、抑菌［4］等功效。临床上主要用于利小便，治疗膀胱结石、肾结石、输尿管结石、肾炎水肿、湿热黄疸、胆囊炎、胆石症、腮腺炎、烧伤等［5］。我国连钱草资源丰富，除西北、内蒙古外，各地均有栽培。

研究表明植物多糖尤其是药用植物多糖具有抗氧化［6］、免疫调节［7］、抗肿瘤［8］、抗炎［9］等功能，但目前对连钱草化学成分的研究主要集中在有机酸［10］、生物碱［11］、苷［12］、黄酮［13］、挥发油［14］等方面，尚无连钱草多糖研究的报道。本研究采用响应面分析优化了热水浴提取连钱草多糖的工艺，以期为连钱草这一传统中药的进一步开发利用奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

连钱草南京同仁堂洪泽中药材科技有限公司提供，经刘晓鹏副教授鉴定为唇形科活血丹属植物活血丹［Glechoma longituba（Nakai）Kupr.］；葡萄糖、无水乙醇、蒽酮、硫酸分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

TU-1810型紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；RT-02A型多功能粉碎机弘荃机械企业有限公司；BECKMAN COUCTER型离心机美国BECKMAN公司；HHS型恒温水浴锅上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.2实验方法

1.2.1连钱草多糖的提取将连钱草60℃烘干、粉碎，过60目筛。称取一定量的连钱草粉末，加适量的一定pH的缓冲液，水浴提取。将浸提液离心（8000r/min，20min），将无水乙醇缓缓加入上清液中，边加边搅拌，使乙醇终浓度为80%。将醇沉液离心（8000r/min，20min），将入蒸馏水溶解沉淀。按多糖溶液∶三氯甲烷∶正丁醇三者体积比25∶5∶1混合，振荡20min，离心（8000r/min，20min）。蒽酮-浓硫酸法［15］测上清液中的多糖，按下列公式计算提取率：

式中：c为测定样液的质量浓度（mg/mL）；V为提取体积（mL）；m为连钱草质量（mg）。

1.2.2单因素实验

1.2.2.1pH对连钱草多糖提取的影响称取一定量的连钱草粉末，在液固比30∶1（mL/g）、水浴温度90℃和提取时间120min下，分别以pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0缓冲液提取多糖，考察不同pH对连钱草多糖提取的影响。实验重复三次。

1.2.2.2液固比对连钱草多糖提取的影响称取一定量的连钱草粉末，加入pH7.0的缓冲液，90℃水浴，提取120min，分别按液固比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g），考察不同液固比对连钱草多糖提取的影响。实验重复三次。

1.2.2.3提取温度对连钱草多糖提取的影响称取一定量的连钱草粉末，按液固比30∶1（mL/g）加入pH7.0的缓冲液，分别置于60、70、80、90、98℃水浴，提取时间均为120min，考察不同温度下连钱草多糖提取率的变化。实验重复三次。

1.2.2.4提取时间对连钱草多糖提取的影响称取一定量的连钱草粉末，于pH7.0、液固比30∶1（mL/g），提取温度90℃条件下分别提取60、90、120、150、180min，计算多糖提取率，以考察不同提取时间对连钱草多糖提取的影响。实验重复三次。

1.2.3Box-Behnken实验根据单因素实验结果，采用Design-Expert 8.0软件进行Box-Behnken实验设计，以pH、液固比、提取温度和提取时间为自变量，多糖提取率为响应值优化连钱草多糖的提取工艺。实验因素水平设计见表1。

表1　因素水平表Table 1　Levels and factors table

1.2.4数据分析单因素实验数据用Origin 8.0统计软件进行单因素方差分析，数据以平均数±标准误（SE）表示，组间差异比较采用Tukey实验。Box-Behnken实验设计和结果分析采用Design-Expert 8.0软件。

2　结果与分析

2.1单因素实验结果

2.1.1pH对连钱草多糖提取的影响不同pH对连钱草多糖提取的影响如图1所示。由图1可以得知：当提取液的pH为7.0时，连钱草多糖的提取率最高，并与其他pH条件时的提取率差异极显著（p＜0.01）。说明连钱草多糖在pH7.0时，溶解性及稳定性最好，过酸过碱的提取条件可能会降低连钱草多糖的溶解性能或增加其水解。

图1　pH对多糖提取率的影响Fig.1　Effect of pH on polysaccharides yield

2.1.2液固比对连钱草多糖提取的影响不同液固比会显著影响连钱草多糖的提取率（图2）。随着液固比的增加，提取率随之增加，当液固比达到30∶1（mL/g）时，提取率的增加不再显著（p＞0.05），当液固比为50∶1（mL/g）时，多糖的提取率反而有所下降。这是因为随着液固比增加，多糖的溶出会增加，但过大的液固比会使后续操作体积过大从而增加损耗，反而使提取率下降。

图2　液固比对多糖提取率的影响Fig.2　Effect of liquid-solid ratio on polysaccharides yield

2.1.3提取温度对连钱草多糖提取的影响如图3所示，提取温度对连钱草多糖提取有着显著影响。提取温度为98℃时提取率最高，但与90℃水浴提取相比，差异不显著（p＞0.05）。这可能是因为提高温度会使植物细胞内的多糖溶出增加，但过高的温度会增加多糖的降解。

2.1.4提取时间对连钱草多糖提取的影响如图4所示，随着提取时间的延长，连钱草多糖的提取率也显著增加，但当提取时间达到150min后，提取率的增加不再显著。这是因为随着加热时间的延长，连钱草多糖溶出增加，细胞内外的多糖浓度梯度降低，最终达到平衡，溶出的多糖不再显著增加。

图3　提取温度对多糖提取率的影响Fig.3　Effect of extraction temperature on polysaccharides yield

图4　提取时间对多糖提取率的影响Fig.4　Effect of extraction time on polysaccharides yield

表2　Box-Behnken实验结果Table 2　Results of Box-Behnken experiment

表3　Box-Behnken实验结果方差分析表Table 3　ANOVA of Box-Behnken experiment results

2.2Box-Behnken实验结果

2.2.1回归模型的建立和检验表2为Box-Behnken实验的结果。采用Design-Expert 8.0统计软件对实验结果进行分析，建立了四元二次回归方程：

R=3.32+0.13A+0.13B-0.10C+0.09D-0.01AB-0.09AC+0.14AD+0.068BC+0.15BD+0.04CD-0.28A2-0.26B2-0.30C2-0.26D2。

该模型的决定系数R2为0.9564，校正后的R2为0.9128。对实验结果进行方差分析，结果如表3所示。从中可以得知：模型显著p＜0.0001，失拟项不显著，说明该模型与实际情况拟合较好。根据F值，各因素对响应值影响大小的顺序为B＞A＞C＞D。除AB、BC、CD外，其余因子对提取率的影响均显著，故可将AB、BC、CD从回归方程中删除，因此，最终的回归方程为R=3.32+0.13A+0.13B-0.10C+0.09D-0.09AC+0.14AD+ 0.15BD-0.28A2-0.26B2-0.30C2-0.26D2。

2.2.2两因素间的交互作用作用显著的两因素间的交互作用如图5～图7所示，三组图直观地反应了当其他两个因素处于最佳水平时，pH与提取温度、pH与提取时间和液固比与提取时间的交互作用对连钱草多糖提取率的影响。

图5为液固比为33.3∶1（mL/g）、提取时间为160.2min时，提取液pH和提取温度对多糖得率的影响。从图5可以看出，当pH和提取温度都处于低水平时，提取率很低，随着二者的上升，提取率急剧上升，当pH和提取温度分别在7.0～7.5和85～90℃范围内时，提取率最高。

图5　pH和提取温度交互作用对多糖提取率的影响Fig.5　Interactive effects of pH and extraction temperature on polysaccharides yield

图6表示的是当液固比33.3∶1（mL/g）、提取温度89.2℃时，pH和提取时间的交互作用对多糖提取率的影响。如图6所示，pH和提取时间的增大会显著提高连钱草多糖的得率，当pH在7.0～7.5之间、提取时间在150～180min范围时，多糖的得率达到最大值。

图6　pH和提取时间交互作用对多糖提取率的影响Fig.6　Interactive effects of pH and extraction time on polysaccharides yield

当pH7.17，提取温度89.2℃时，液固比和提取时间交互作用对多糖产量的影响如图7所示。当液固比较小、提取时间较短时，多糖产量较低，随着液固比的加大、提取时间的延长，多糖产量显著增加。当液固比处于30∶1～40∶1（mL/g）、提取时间150～180min时，多糖产量最高。

2.2.3最佳工艺优化及验证实验根据建立的回归方程进行各因素的优化，得到当A=0.34、B=0.33、C= -0.16、D=0.34时，R有极大值3.39%。即当连钱草多糖提取条件为pH7.17、液固比33.3∶1（mL/g）、提取温度89.2℃、提取时间160.2min时，多糖得率可达3.39%。为了方便操作，提取工艺被确定为pH7.2、液固比33∶1（mL/g）、提取温度89℃以及提取时间为160min。对优化的工艺进行三次验证，每次实验重复三次，三次的多糖提取率分别为3.26%±0.05%、3.52%±0.08%、3.41%±0.038%，平均提取率为3.40%±0.05%，说明建立的回归模型有较好的预测性，优化的工艺对生产实践具有很好的指导作用。

图7　液固比和提取时间对多糖提取率的影响Fig.7　Interactive effects of liquid-solid ratio and extraction time on polysaccharides yield

3　结论

pH、液固比、提取温度和提取时间是影响多糖提取的四个重要因素，为了研究这四个因素对连钱草多糖提取率的影响，先进行了单因素实验，并在此基础上进行了Box-Behnken响应面试验。得出提取连钱草多糖的最佳工艺是pH7.2、液固比33∶1（mL/g）、提取温度89℃、提取时间160min，并对该工艺进行了验证，连钱草多糖的提取率可达3.40%±0.05%。

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Optimization of extraction process of polysaccharides from Glechoma longituba by Box-Behnken design-response surface method

JIANG Ning1，LIU Xiao-peng1，2，*，ZHANG Jun-xia1，JIANG Ya-dong3，DING Zhen-guo3，LI Li2
（1.School of Biological Science and Technology，Hubei Institute for Nationalities，Enshi 445000，China；2.Postdoctoral Research Station，Nanjing Medical Co.，Ltd.，Nanjing，Nanjing 210012，China；3.Nanjing Tongrentang Hongze Chinese Herbal Science&Technology Co.，Ltd.，Hongze 223200，China）

Polysaccharides from Glechoma longituba were extracted in the present study，and four factors including pH，liquid-solid ratio，extraction temperature and time were optimized by univariate tests and response surface methodology.The results showed that the highest yield of polysaccharides extracted from Glechoma longituba reached 3.40%±0.05%when the process was pH7.2，liquid-solid ratio 33∶1（mL/g），temperature 89℃ and extraction time 160min.This research might provide a theoretical basis for the further development and utilization.

Glechoma longituba；Box-Behnken design；response surface method；polysaccharides；extraction

TS201.1

B

1002-0306（2015）14-0279-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.056

2014－09－12

姜宁（1968-），女，在读博士，副教授，研究方向：生物工程。

刘晓鹏（1971-），男，博士，副教授，研究方向：生物工程。

国家“十二五”科技支撑计划项目（2011BAI04B04）；江苏省“企业博士后集聚计划”项目（2011033）；2013年湖北省战略性新兴（支柱）产业人才培养（生物工程）项目。