硝酸纤维素膜的再生处理及其吸附蛋白能力的研究*

李福刚

[文章编号] 1672-8270(2015)09-0014-04 [中图分类号] R392.33 [文献标识码] A

硝酸纤维素膜的再生处理及其吸附蛋白能力的研究*

李福刚①*

[文章编号] 1672-8270(2015)09-0014-04 [中图分类号] R392.33 [文献标识码] A

目的：解决硝酸纤维素膜老化在金标斑点定性或定量渗滤试验检测系统中带来的检测结果不准确的问题。方法：以两项胶体金斑点免疫渗滤试验——结核分枝杆菌抗体胶体金法定性检测(TB-DOT)和人绒毛膜促性腺激素金标法定量检测(HCG-DOT)为研究模式，对比3-甲基-1-丁醇处理前后的老化膜与正常膜的呈色结果、流速、吸附能力及稳定性等。结果：实验数据证实，处理后的硝酸纤维素膜流速提高14.4%，吸附能力明显增强，变异系数(CV)值均小于未处理的膜，稳定性良好，与新膜保持一致，表明再生处理的方法能够在一定程度上改善膜的性能。结论：本研究所使用的方法，不但解决了胶体金快速定量免疫化验测定试剂盒在生产中遇到的膜老化问题，也保证了产品在临床应用中具有更好的准确性。该解决方法具有一定普遍意义，同样适用于即时检验(POCT)类其他使用硝酸纤维素膜的诊断产品。

硝酸纤维素膜；再生处理；吸附能力

[First-author’s address] Shanghai Upper Bio-Tech Pharma Co. Ltd. Shanghai 201201, China.

在金标斑点定性或定量渗滤试验检测系统中，用于固相抗原或抗体的硝酸纤维素膜的质量优劣和稳定性是影响检测结果的重要因素，入库时质量好的硝酸纤维素膜往往因老化而影响其原有的质量和稳定性[1-9]。快速的金标法结核定性检测(TB-DOT)及金标法HCG定量测定(HCG-DOT)是一种免疫胶体金渗滤试脸，属即时检测(point of care testing，POCT)范畴，数分钟可测得结果[10-12]。但在产品大规模的生产过程中，会有部分硝酸纤维素膜由于温度、湿度及效期等综合原因而出现老化现象，导致产品在临床应用中出现检测结果不准确的现象[13-14]。如果遇到巳有老化现象或有老化倾向的膜，可采取各种再生处理措施，以保证质量，继续用于生产，确保生产不间断，同时可使原材料不浪费。使用3-甲基-1-丁醇处理老化的硝酸纤维素膜是文献中报导过的再生方法[15]。为此，本研究将3-甲基-1-丁醇处理前、后的硝酸纤维素膜与正常膜进行实验对比，在此基础上寻找出大规模生产中可行的处理方法。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

存放多年、巳呈老化现象的硝酸纤维素膜及新购合格对照批次硝酸纤维素膜，其孔径均为0.45 μm，均购自美国通用电气公司；3-甲基-1-丁醇购自Sigma公司；HCG单抗购自Medix公司；HCG-DOT试剂盒、TB-DOT试剂盒及U2金标斑点法定量读数仪均购自上海奥普生物医药有限公司。

1.2 硝酸纤维素膜再生处理方法

配置浓度为1%的3-甲基异丁醇溶液200 ml，置于恒温水箱中加热到60 ℃，取老化硝酸纤维素膜，浸泡于溶液中维持15 min，取出后用纯水洗涤5遍，然后在8%的甘油溶液中浸泡30 min，再用滤纸挤压处理后的膜，去除多余的甘油，凉干后置于塑封袋中室温保存备用。

1.3 试验方法

分别采用未处理和处理过的已老化的硝酸纤维素膜按照上海奥普生物医药有限公司生产工艺规程，制备HCG-DOT反应板和TB-DOT反应板，制备流程如图1所示。

图1 HCG-DOT反应板制备流程图

将正常生产检验合格的试剂盒中的反应板作为对照，并将以上3种反应板分别与合格试剂盒中的配套试剂组合进行测试，测试操作流程参照试剂说明书，比较未处理、再生处理以及对照试剂盒的各项性能指标。未处理硝酸纤维素膜制备反应板为观察A组，处理过硝酸纤维素膜制备反应板为观察B组，正常生产检验合格的试剂盒中反应板为对照组。

2 结果

2.1 流速比较

取3组反应板块，分别在板中加入850 μl水，用秒表计时，观察水全部渗入所用的时间，整卷膜分成6个区域，每个区域取样两点，计算12个点的流速均值和变异系数(coefficient variation，CV)值(如图2所示)。

图2 流速比较示图

图2 显示，硝纤膜经3-甲基-1-丁醇处理再生后其渗滤速度有所提高，较处理前提升14.4%，提示其浸润性大幅改善。同时，处理后的流速CV值较未处理的低8.76%，与对照组接近，表明处理后膜的均一性有很大改进。

2.2 吸附能力比较

取3组TB-DOT反应板，通过观察其斑点显色情况来判断处理后膜对TB抗原的吸附能力，结果见表1。

实验结果显示，处理后的硝酸纤维素膜在溶液的浸润性方面要明显好于未处理膜，处理后膜阳性呈色斑点颜色也略深，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明其蛋白吸附能力确实有增强，避免了低浓度阳性标本误判为阴性的情况发生。同样，在反应板上依次滴加2滴封闭液，6滴洗涤液，100 μl金标液，不加样品或阴性与阳性对照，以直接观察膜对质控点包被蛋白的吸附能力。质控点包被蛋白是纯化的羊抗人IgG，其被吸附在膜上后即便不捕获人样品中的IgG，也能与红色胶体金缀合物反应，因为缀合胶体金的葡萄球菌A蛋白能与羊IgG结合。发现处理后的质控点颜色较处理前略深，表明固定在膜上的羊IgG较未处理的多，与胶体金颗粒结合量大，故颜色略深，形状较均匀。实验结果显示，观察A组质控点颜色较浅，显色会出现空斑，观察B组与对照组表现一致，颜色较深，形状圆润，色泽均匀。

取3组HCG-DOT反应板，每组分别测试3个浓度质控品和非怀孕妇女血清，每个浓度测试10次，计算均值和CV值，通过观察斑点在仪器上的测试结果来判断处理后硝酸纤维素膜对HCG单抗吸附能力，其结果见表2。

表1 TB抗原吸附能力比较

表2 HCG单抗吸附能力比较

表3 TB抗原加速稳定性比较(37 ℃放置10 d)

表4 HCG单抗稳定性比较(37 ℃放置10 d)

表2显示，用处理后的硝酸纤维素膜所测得的值高于未处理的膜。其中200 mIU/ml高出8%，1000 mIU/ ml高出29%，10000 mIU/ml高出7%。从定量的HCGDOT角度比对，表明经醇的处理后老化的硝酸纤维素膜可以再生，其吸附蛋白能力有所增强。且CV与未处理的相比较低，与对照组结果相一致，表明处理后精密度好，重复性高，能改进膜的均一性。故膜对HCG单抗吸附能力越好，在相同条件下测定结果越高。

2.3 稳定性比较

取3组TB-DOT反应板，通过37 ℃加速试验观察其斑点显色情况来判断处理后硝酸纤维素膜上TB抗原的稳定性，其结果见表3。

表3结果与表1相比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色的变化与10 d前相比基本一致，稳定性很好。处理后硝酸纤维素膜用于TB-DOT试剂盒，37 ℃放置10 d后的质控点颜色与10 d前接近，形状均匀，无空斑，且与对照组相同。

取3组HCG-DOT反应板，每组分别测试3个浓度质量控制品，每个浓度测试10次，计算均值和CV，通过37 ℃加速试验(10 d)观察其斑点在仪器上的测试结果来判断处理后膜上HCG单抗的稳定性，与10 d前各浓度的平均值及CV值作对比发现，10 d后处理前后各浓度的测试值均略有变化，但幅度甚微。处理过的硝酸纤维素膜在200 mIU/ml、1000 mIU/ml及10000 mIU/ml分别升高1.6%、4.3%及降低0.1%，与处理后4 ℃比较以及对照组膜37 ℃放置10 d相比较变化幅度均不显著(见表4)。

HCG单抗稳定性比较，10 d前、后TB抗原、HCG单抗的反应情况显示，处理后的膜吸附性能良好，效价未降低，能保证相当的稳定性，不会影响反应结果。

3 结论

结合生产中遇到的不同程度老化硝酸纤维素膜的实际情况，采取整体再生处理的方法，综合对处理前后硝酸纤维素膜的流速、均一性、吸附能力、稳定性以及质控点的比较，可以看到经3-甲基-1-丁醇的再生处理后，流速提升14.4%，吸附能力明显增强，稳定性保持良好，且CV值均小于未处理的，与正常的新购膜各种指标相一致。表明再生处理的方法确实能在一定程度上改善膜的性能。由于醇类能够减少溶液的表面张力和降低静电斥力来显著提高膜的浸润性和稳定性，因此处理后的膜其浸润性要好于未处理的；加入少量的醇能降低蛋白在溶液中的稳定性，而蛋白在包被时稳定性差反而在膜上容易固相被吸附，少量醇的添加不会导致蛋白质的变性或沉淀，可以促进蛋白质在硝酸纤维素膜上的被吸附。浓度极低的醇的存在会促进蛋白的固定，保证了硝酸纤维素膜的稳定性。

通过对不同老化状况的硝酸纤维素膜采取整体再生处理方法，既可以保证产品的质量又节省了成本，提高了膜的利用率。通过课题研究，基本解决了胶体金快速定量免疫化验测定试剂盒在批量生产中遇到的硝酸纤维素膜老化问题，这些生产中应急的解决方法具有一定普遍意义，不仅局限在TB-DOT和HCGDOT的生产控制上，还适用于POCT类其他快速金标诊断产品，不但解决了企业生产中的主要原材料老化问题，也保证了产品在临床应用中具有更好的准确性。

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Study on protein adsorption ability and the regeneration of nitrocellulose membrane/LI Fu-gang// China Medical Equipment,2015,12(9)∶14-17.

Objective∶ To solve the inaccurate results caused by the aging of nitrocellulose membranes in qualitative or quantitative immuno-colloidal gold infiltration tests. Methods∶Using qualitative TB-DOT and quantitative HCG-DOT immuno-colloidal gold filtration test systems, we compared the treated coloration, circulation velocity, adsorbing power and stability of nitrocellulose membrane of good quality, 3-methyl-1-butanol treated and untreated aged membranes. Results∶ Abundant results has approved that the regeneration of aged nitrocellulose membrane by 3-methyl-1-butanol treatment lead to 14.4% faster flow velocity, stronger absorption capability, better stability, and lower CV value, compared to untreated membranes. Conclusion∶ The mentioned method solves the problem caused by the aging of nitrocellulose membranes, and assures the accuracy of measurements. Furthermore, it is an universal solution that can be applied to other POCT products.

Nitrocellulose membrane; Regeneration; Absorption ability

李福刚,男,(1975- ),硕士，高级工程师。上海奥普生物医药有限公司总经理，从事体外诊断试剂研发管理工作。

2015-04-19

科技型中小企业技术创新基金(05C26213100490)“金标斑点法定量检测系统技术平台的产业化”

①上海奥普生物医药有限公司 上海 201201

*通讯作者：lfg@poct.cn

DOI∶ 10.3969/J.ISSN.1672-8270.2015.09.005