甘油稀释浓度对牛冻精活率的影响

张鹏 弓瑞娟

（山西省畜牧遗传育种中心030027）

甘油稀释浓度对牛冻精活率的影响

张鹏 弓瑞娟

（山西省畜牧遗传育种中心030027）

研究不同浓度的甘油对牛精液在冷冻后的活率，观察到甘油在牛冷冻精液稀释液的添加浓度为4%时，不但足以保护精子细胞，而且可以在冷冻过程中将损害降到最小，表明4%的甘油浓度对牛精子冷冻的效果最好。

牛精子；甘油浓度；精子活率；精子顶体完整率

近年来我国种公牛站在配制牛冷冻精液的稀释液时所采用的防冻保护剂大多为甘油，本文通过不同浓度的甘油对牛冷冻精液在冷冻后活率的影响试验，探讨不同浓度甘油对牛精子在冷冻过程中的影响，从而筛选出有利于牛精子冷冻的最佳甘油浓度。

甘油的分子量为92.09，结构简式为CH2OHCHOHCH2OH，甘油的理化特性具有溶于水不易发生结晶、吸水性强和可降低水溶液冰点的特点；当牛精液冷冻时，主要受到的危害是冰晶从精细胞原生质中抽去水，使精细胞造成脱水状态，发生不可逆的变化死亡，而甘油可以减少和降低这种对精细胞的损害作用。

1 材料与方法

1.1 牛冷冻精液稀释液配方

用电子天平准确称量配制稀释液所需的药品，所用药品为分析纯。

配方Ⅰ葡萄糖、三羟甲基胺基甲烷、0%甘油

配方Ⅱ葡萄糖、三羟甲基胺基甲烷、2%甘油

配方Ⅲ葡萄糖、三羟甲基胺基甲烷、3%甘油

配方Ⅳ葡萄糖、三羟甲基胺基甲烷、4%甘油

配方Ⅴ葡萄糖、三羟甲基胺基甲烷、5%甘油

配方Ⅵ葡萄糖、三羟甲基胺基甲烷、6%甘油

以上6种配方均灭菌后加入相同量的卵黄和相同量的抗菌素。

1.2 试验方法

选出山西省畜牧遗传育种中心正常参加采精的荷斯坦种公牛10头进行采精，采得精液后先对精液进行质检，各项指标合格且活率均在0.6以上者方可用于本次试验。将经过初步检测的牛精液分别用以上6种稀释液并根据牛精液品质的不同，按照有效精子数300～500万/剂进行稀释后分装入0.25ml细管。将这些牛精液细管按照不同的甘油浓度分成6组放入4℃恒温冰箱平衡3～4h后放入全自动冷冻仪进行冷冻。经过7min的冷冻后迅速取出放入液氮中保存。将冷冻好的牛精液按照每组每头牛抽取10支的方法依照标准解冻，要求解冻后进行活率检测（用细管中1/2的精液量）并记录结果，同时进行精子顶体完整率的检测 （用活率检测后细管中剩余的1/2精液）并记录结果。

1.3 统计分析

这次试验采用次级样本含量相等的系统分组分析方法进行方差分析，并且进行F检验。

2 结果

通过分析试验结果可以得出：不同甘油浓度对牛精液冷冻后活率的影响差异极显著 （P＞0.01）， 甘油浓度为4%显著高于5%和6%，极显著高于0%、2%和3%；5%极显著高于3%，6%显著高于3%，5%和6%极显著高于0%和2%，5%显著高于6%；3%显著高于2%，2%和3%极显著高于0%。而甘油浓度相同的牛冻精之间的活率差异均不显著 （P＞0.05）， 见表1。

表1 6种不同甘油浓度的精子冻后平均活率比较 （SSR法）

不同甘油浓度对牛精液冷冻后精子顶体完整率的影响差异极显著 （P＞0.01），甘油浓度为4%显著高于3%和5%，极显著高于0%、2%和6%；3%与5%显著高于2%和6%，极显著高于0%，3%显著高于5%；2%显著高于6%，2%和6%极显著高于0%。而甘油浓度相同的牛冻精之间的顶体完整率差异均不显著 （P＞0.05）， 见表2。

3 讨论

3.1 甘油对牛精液冷冻时的保护作用

（1）甘油冲淡溶液中溶质的浓度。甘油可以进入精细胞内代替细胞内部分游离水，使游离水连同无机盐被排出，降低了细胞内溶质的浓度，从而在冷冻时可阻止在-15℃以下引起精子细胞蛋白质变性。

（2）甘油降低了稀释后精液的冰点，使精液处于过冷状态，因此在-15℃以下才结冰，减缓了细胞的皱缩程度和脱水速度。

（3）减少在形成冰晶时渗入细胞内盐类的数量。

（4）甘油可以通过细胞膜，在解冻中可以保护精子。

（5）甘油可以保护精子细胞内一部分酶免受冻害而逸出 （GOT）。

表2 6种不同甘油浓度的精子冻后顶体完整率比较 （SSR法）

3.2 甘油浓度对牛精液冷冻后活率影响

试验结果表明4%的甘油浓度对牛精液冷冻后活率最好，4%的甘油浓度最适宜保护精子的顶体完整。说明4%的甘油浓度可以最好的保护精子细胞，并且能够将损害作用降到最低。虽然甘油浓度＜4%时 （2%、3%）对精子的损害程度要好于甘油浓度＞4%时 （5%、6%），但是甘油浓度＜4%时 （2%、3%）对精子细胞冷冻时的保护效果要差于甘油浓度＞4%时 （5%、6%）。

3.3 试验结论

发现甘油浓度过低就不能形成对精子细胞的保护，使得精子遭受冷打击造成精子冷休克和死亡；而甘油浓度过高，容易产生渗透损伤或对精子造成毒害作用使精子慢性中毒，因为甘油浓度过高使得稀释液中渗透压明显升高，这种高渗透压导致精子顶体破损比例升高，精子细胞中GOT酶泄出量增加。本试验证明甘油在牛冷冻精液稀释液的添加浓度为4%时，不但足以保护精子细胞，而且可以在冷冻过程中将损害降到最小，表明4%的甘油浓度对牛精子冷冻的效果最好。