乳杆菌产生的抑菌活性物质对酵母细胞膜通透性的影响

陈忠军，李海瑄，高鹤尘

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特010018）

0 引言

酵母菌应用很早，在酿酒、食品、医药工业等方面占有重要地位。某些酵母菌可引起人和植物的病害[1]。故在食品工业中，防腐保鲜极为重要。近年来人们越来越重视天然安全、适用性广且性能稳定的生物防腐剂[2]。

生物防腐保鲜技术就是利用有益微生物作为保护菌株，以杀死或抑制腐败菌和致病菌，延长食品贮藏期，提高安全性。乳杆菌是公认的安全生物，即能改善食品风味，且对其它细菌存在天然的排斥性[3]。

乳杆菌不仅能抑制多种细菌的生长，也能产生抗真菌化合物，对真菌起到抑制作用[4-6]。目前对具抑细菌活性的乳杆菌的研究工作已经有很大进展，但对于具抑真菌能力乳杆菌的研究还较新，且对抑酵母菌活性物质抑菌作用机理的研究甚少。

因此，对从内蒙古传统发酵食品中筛选出的具有抑酵母菌作用的乳杆菌进行深入研究，揭示其抑菌作用机理具有重大的理论意义，在开发天然食品防腐剂及其利用方面具有广阔的前景。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 菌株

实验菌：ALAC-3、ALAC-4，从内蒙古传统发酵食品中分离得到，为乳杆菌属。

指示菌：白假丝酵母（Candida albicans），中国微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 培养基

乳杆菌培养基：MRS培养基；指示菌培养基：YEPD培养基；抑菌活性检测培养基：水琼脂培养，TSB培养基配制方法见参考文献[7-8]。

1.1.3 试剂

牛肉膏，大豆蛋白胨，胰蛋白胨，酵母提取粉，葡萄糖，吐温80，柠檬酸铵，乙酸钠，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸锰，磷酸二氢钾，氯化钠，柠檬酸氢二铵，Agar，硫酸铵（分析纯），磷酸缓冲液，牛血清蛋白，Trizma base，考马斯亮蓝G-250等。

1.1.4 仪器

FLC-3型超净工作台，HVE-50型全自动高压灭菌锅，SPX-1500型恒温恒湿培养箱，BCD-245D型冰箱，12001型上皿电子天平，HM-12型pH计，万用电热器，L600型低速自动平衡离心机，RE-52AA型旋转蒸发器，游标卡尺（精密度0.02 mm），DDBJ-350型便携式电导率仪，T6新世纪紫外可见分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化及抑菌物浓缩液的制备

将半固体穿刺保存的乳杆菌菌株接种到MRS液体培养基中活化一代（37℃，16～24 h），将第一代发酵液离心（3 000 r/min，10 min），取上清液。再用旋转蒸发器对上清液进行浓缩至25倍，得到浓缩液。

1.2.2 抑菌物质的粗提

（1）饱和硫酸铵溶液的制备。取分析纯NH4）2SO4800 g，加蒸馏水1 000 mL，不断搅拌下加热至50～60℃，并保持数分钟，趁热过滤，滤液在室温中过夜，有结晶析出，即达到100%饱和度，用浓氨水调pH值为7.0，备用。

（2）硫酸铵饱和度的确定。向抑菌物浓缩液中加入一定量的饱和硫酸铵溶液以达到所需硫酸铵饱和度，饱和溶液添加量计算如式（1）[9]。使硫酸铵的终饱和度为30%，40%，50%，60%，70%，80%，于4℃冰箱放置过夜，第二天冷冻离心（4℃，8 000 r/min，20 min），收集沉淀用pH值为6.0浓度0.02 mol/L磷酸盐缓冲液溶解，将指示菌接种到无菌生理盐水中，调至浓度为105mL-1，并充分混匀，得到供试菌悬液。采用牛津打孔平板法进行活性检测，根据抑菌透明圈直径的大小，确定应采用的硫酸铵饱和度。此饱和度下的上清液中残存的抑菌活性物质几乎被完全沉淀[10]。

式中：V0为蛋白质溶液的原始体积；C2为所要达到硫酸铵饱和度；C1为原来溶液的硫酸铵饱和度；V为应加入饱和硫酸铵溶液的体积。

（3）抑菌物质粗提液的制备。根据确定的硫酸铵饱和度，在浓缩液中加入适量的饱和硫酸铵溶液，放入4℃冰箱中放置过夜，取出后高速离心（8 000 r/min，20 min），弃去上清液可得含蛋白质沉淀粗提物。用无菌水配置成不同质量浓度的粗提液，质量浓度分别为0.04，0.4，0.5，4 g/mL，放入-20 ℃冰箱中备用。

1.2.3 指示菌菌悬液的制备

将酵母菌从斜面保存中接种到YEPD液体培养基中活化一代（30 ℃，36～48 h），取200 μL酵母菌液至150 mL灭菌的生理盐水中，并用混匀器混匀，得到供试菌悬液，使菌悬液浓度为105mL-1。

1.2.4 菌液电导率的测定

取10 mL酵母菌菌悬液，分别加入200 μL不同浓度抑菌物质粗提液，测定其一定时间内的电导率。以不加抑菌物质粗提液为空白对照。

1.2.5 菌液中可溶性蛋白的测定

（1）牛血清蛋白浓度——吸光度标准曲线的绘制。以牛血清蛋白（BSA）作为标准蛋白，称取10 mg的BSA溶于少量去离子水中，定容到10 mL，成为质量浓度为10 g/L原液。分别取原液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于不同试管中，再分别加入1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL去离子水，使总体积为1.0 mL。分别加入5.0 mL考马斯亮蓝G-250反应液于各试管中，震荡摇匀，放置2 min后使用紫外可见分光光度计，1 cm的石英比色杯，在595 nm处测定吸光值，以去离子水加反应液为空白对照。蛋白质质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，重复三次[11]。

（2）供试菌蛋白质提取。在酵母菌菌悬液中加入抑菌物质粗提液，分别处理2、6、10、24 h后取出1 mL，之后分别加入5倍体积的Tris-HCl缓冲液。以不加抑菌物质粗提液为空白对照。

（3）样品蛋白质的测定。准确吸取0.1 mL各处理样品于10 mL的具塞试管中，加入5 mL考马斯亮蓝G-250染色剂，混合均匀后放置2 min，用10 mm厚的比色杯在波长595 nm处测定光度值，从标准曲线中查的相应的蛋白质含量[12]。

2 结果与分析

2.1 硫酸铵饱和度的确定

不同蛋白质粗提所使用的最佳硫酸铵饱和度不同。按照1.2.2.2的方法对菌株ALAC-3、菌株ALAC-4的抑菌物质进行粗提，分别用上清液和沉淀溶液作抑菌实验，结果如表1和表2所示。

表1 ALAC-3硫酸铵饱和度的确定

表2 ALAC-4硫酸铵饱和度的确定

由表1和表2可以看出，菌株ALAC-3和菌株ALAC-4均在硫酸铵饱和度为40%时，大部分活性物质被沉淀下来，使得此饱和度下的抑菌圈直径达到最大值。因此，两种菌株抑菌物质粗提的硫酸铵最佳饱和度均为40%。

2.2 抑菌物质对酵母菌液电导率的影响

细胞膜是细菌的保护屏障，当细菌遇到强抑菌剂而使细胞膜遭到破坏时，菌体的保护屏障被打破，使其内部电解质外泄至培养液中，进而使培养液的电导率上升。因此，菌液电导率的变化反映了细菌细胞膜通透性的变化[13]。

按照1.2.5的方法将两种菌抑菌物质粗提液分别与酵母菌菌悬液混合处理不同时间后，测定其电导率，结果如图1和图2所示。

图1 ALAC-3不同质量浓度粗提液对酵母菌菌悬液电导率的影响

图2 ALAC-4不同质量浓度粗提液对酵母菌菌悬液电导率的影响

由图1和图2可以看出，粗提液质量浓度为0.04 g/mL时处理酵母菌悬液，其电导率均低于对照。其原因可能是在上述条件下，抑菌物质并没有破坏细胞膜，而是与细胞膜外表面发生了静电结合，导致带电离子减少，使培养液的电导率降低；随着质量浓度的增大，电导率也随之增大，说明质量浓度越高对细胞膜的破坏越大。

对于菌株ALAC-3，在抑菌物质粗提液质量浓度为4 g/mL处理酵母菌悬液，菌液电导率明显增大；而菌株ALAC-4在粗提液质量浓度为0.5 g/mL时，酵母菌液电导率就发生明显增大，说明这两株菌所产生的抑菌物质对酵母菌细胞膜通透性的影响不同，菌株ALAC-4对于酵母细胞膜通透性的破坏明显强于菌株ALAC-3。

在4 g/mL质量浓度下，1 min时两株菌的电导率均显著上升，之后趋于稳定，说明抑菌物质在1 min时就发挥了作用，使指示菌胞内的离子渗出，从而达到抑菌的目的。

2.3 抑菌物质对菌液中可溶性蛋白的影响

2.3.1 牛血清蛋白标准曲线

按照1.2.5（1）的方法绘制牛血清蛋白标准曲线，结果如图3所示。

根据图3，可得其线性回归方程为y=0.1475x+0.0395，其中R2=0.9954（＞0.99）。

2.3.2 抑菌物质对菌液中可溶性蛋白的影响

图3 牛血清蛋白标准曲线

按照1.2.5（2）和1.2.5（3）的方法将两种菌抑菌物质粗提液分别与酵母菌菌悬液混合处理不同时间后，测定其吸光度。根据所得标准曲线得出可溶性蛋白质量浓度，结果如图4和图5所示。

图4 ALAC-3不同质量浓度粗提液对酵母菌菌悬液中可溶性蛋白的影响

图5 ALAC-4不同质量浓度粗提液对酵母菌菌悬液中可溶性蛋白的影响

由图4和图5可以看出，经各质量浓度粗提液处理2 h时可溶性蛋白质量浓度均大于对照，表明抑菌物质可以改变酵母菌细胞膜的通透性，致使蛋白质渗漏到膜外；随着质量浓度的增大，蛋白质质量浓度也随之增大，说明质量浓度越高对细胞膜的破坏越大。

菌株ALAC-3在质量浓度为4 g/mL时，可溶性蛋白明显增大；而菌株ALAC-4在质量浓度为0.4 g/mL时，可溶性蛋白就发生明显增大，说明这两株菌所产生的抑菌物质对酵母菌细胞膜通透性的影响不同，菌株ALAC-4对于酵母细胞膜通透性的破坏明显强于菌株ALAC-3，这一结论与上述测得电导率的结论一致。

2～6 h时可溶性蛋白质质量浓度有较大幅度的减小，随后可溶性蛋白质量浓度有所增加但增幅不大，表明抑菌物质处理对酵母菌产生影响，可能抑制其蛋白质合成的速率。

随着反应时间的延长，抑菌物质的有效抑菌成分受到破坏，可溶性蛋白质量浓度有所升高，之后液体中本身含有的蛋白质被指示菌生命活动所消耗，在处理10 h后可溶性蛋白质质量浓度达到平衡或有所降低。

3 结论

试验可知两株乳杆菌产生的抑酵母活性物质粗提的硫酸铵最佳饱和度均为40%，在此饱和度下，抑菌效果最好。

加入抑菌物粗提液处理酵母菌悬液一定时间后，菌液电导率明显增加，说明抑菌物能改变细胞膜通透性，使菌体内电解质渗漏。且可溶性蛋白质量浓度均高于对照，说明抑菌物质可以改变酵母菌细胞膜的通透性，致使蛋白质渗漏到膜外。菌液电导率和可溶性蛋白的测定结果均表明抑菌物质对酵母菌细胞膜通透性有影响，但可说明其影响程度，既可以使电解质渗漏，也可以使大分子的蛋白质渗漏。

当菌株ALAC-3抑菌物质粗提液质量浓度为4 g/mL时，菌液电导率和可溶性蛋白明显增大，而当菌株ALAC-4抑菌物质粗提液质量浓度分别为0.5 g/mL和0.4 g/mL时，菌液电导率和可溶性蛋白就明显增大。由此可以得出菌株ALAC-4产生的抑菌物质对于酵母细胞膜通透性影响较强。

[1]何国庆，贾英民，丁立孝.食品微生物学[M].北京：中国农业大学出版社，2010：38-43.

[2]张百刚，张宝善.生物防腐剂在食品加工中的应用研究[J].食品研究与开发，2004，25（06）：127-129.

[3]翟光超.酸马奶酒中两株产抑菌物质乳酸菌培养基优化与抑菌物质的提取[D].内蒙古农业大学，2005.

[4]GULAHMADOV S G，ABDULLAEVA N F，GUSEINOVA N F，et al.Isolation and characterization of bacterioCin-like inhibitory Substances from lactic acid bacteria isolated from azerbaijan Cheeses[J].Applied Biochemistry and Microbiology,2009,45：266-271.

[5]宋宏霞，曾名勇，刘尊英，董士远，李夏.抗菌肽的生物活性及其作用机理[J].食品工业科技，2006，27（09）：185-188+197.

[6]郭本恒.益生菌[M].北京：化学工业出版社，2004：5-120.

[7]沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验（第三版）[M].北京：高等教育出版社，1999：214-222.

[8]RE布坎南，N E吉本斯，等.伯杰细菌鉴定手册（第八版）[M].北京：科学出版社，1984.

[9]王桂花，孙庆林，孟凡华.生物化学试验指导[M].内蒙古农业大学自编教材，2011，59-61.

[10]于娜.具有抑菌作用乳杆菌的筛选及其抑菌物质特性的研究[D].内蒙古农业大学，2011.

[11]王兴全，张新虎，杨顺义，等.苍耳提取物对番茄灰霉病菌抑制机理的研究[J].甘肃农业大学学报，2008，43（3）：107-110.

[12]张赟彬，缪存铅，宋庆，郭媛.荷叶精油对肉类食品中常见致病菌的抑菌机理[J].食品科学，2010，31（19）：63-66.

[13]MT马迪根，JM马丁克.微生物生物学（第11版）[M].北京：科学出版社，2009：95-113.