基于微小发光真菌的化妆品化学毒性测试方法

陈兰（海南师范大学 海口 570100）

随着人民生活水平的提升，对于化妆品的利用率越来越高，这就为化妆品的质量提出了很高的要求，但是现如今在市场中流通的化妆品种类纷繁多样，品质也各不相同，一些化妆品中甚至还有许多对人类身体有毒有害的化学成分。这些有毒物质本身具有很强的潜伏期，在经过使用后会存在于人体内进行富集，所以非常不易发现，随着近些年来一些因滥用化妆品导致疾病的事件不断发生，人们开始关注这些有毒物质的检测，但是传统的检测方法往往针对具有某一特点的有毒有害物质，现在已经不能适应不断变异的有毒物质检测工作，经过研究，一种新的检测方法——发光真菌检测法被提出来，并具有很好的效果，本文就针对这种化妆品中有毒物质检测方法进行如下的论述。

1 实验仪器和药剂

进行该检测实验所应用到的化学药剂主要有硫酸铁、亚硫酸铁、氯金酸、柠檬酸三钠、浓度为30%的氨水、鲁米诺、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、Tris碱、APTES、高纯度的氮气、氯化钠、对碘苯酚。应用到的仪器为分光光度计（可见光、紫外线光）、生化培养箱、恒温振荡器、发光检测仪、酶标仪、振动磁强计。

2 实验过程

2.1 四氧化三铁微粒的制备

在制备四氧化三铁微粒时，本实验采用的是化学沉淀法，将硫酸铁溶液和亚硫酸铁溶液按照一定的比例进行混合，然后将碱性的沉淀剂加入混合液中，经过不断的搅拌之后放置，一段时间以后就会得到纳米级的四氧化三铁微粒，具有一定的磁性。

反应的方程式为：

之后再取10mL的微粒按照水和乙醇1比1的比例配制90mL的混合溶液放入到容量为250mL的圆底烧瓶中，进行摇匀，之后再向其中加入300微升的硅烷化试剂盒500微升的氨水，在60摄氏度的条件下向其中通入氮气，以每分钟500转的速度进行搅拌，时间为6小时。之后将其中的微粒取出，用无水乙醇和蒸馏水进行反复地冲洗，直到冲洗出的液体中没有黄色，之后用无水乙醇进行定容，测出其中固体物质的含量。

2.2 合成胶体金

进行胶体金的合成主要是通过氯金酸在白磷、枸橼酸钠、抗坏血酸、鞣酸等物质的还原作用下所析出的一种纳米级别的金颗粒。具体的制备方法为：取浓度为0.01%的氯金酸溶液200mL放入四颈瓶中，之后以每分钟500转的速度于90摄氏度的条件下进行预热搅拌，时间大约为5分钟，之后向其中加入浓度为1%的柠檬酸三钠适量水溶液直到溶液的颜色不发生变化，之后通过冷却回流就能够制备得到粒径在20纳米左右的胶体金，这种物质的外观是橙红色的，需要放在棕色瓶中保存。

2.3 制备TP混合抗原

取0.4mL配制好的合成胶体金，撇清其上清液，用0.5mL偶联缓冲液对其进行清洗以调节pH值的平衡，通过磁性分离撇清其上清液。在磁粒中投加0.5ug/ul的抗原溶液，放于摇床中以每分钟200转的速度搅拌反应30分钟。通过磁性分离，向磁粒中加入封闭液，放入恒温振荡器中以每分钟200转的速度进行搅拌，对磁粒进行封闭，通过磁性分离，撇清其上清液，之后用PBST进行3次清洗，将磁粒放于1mLPBS中保存，通过颠倒混合后保存备用。

2.4 发光检测体系的形成

在每个反应管中个加入30微升的TP混合抗原、HRP标记好的抗原和50pL阳性血清和阴性血清，放入恒温振荡器进行震荡30分钟，温度为37摄氏度，之后取出进行磁性分离，撇清其上清液，用PBST进行反复冲洗，之后再次进行磁性分离，撇清其上清液，向其中加入PBS10微升，最后将样品移到化学发光专用的孔板中，分别加入20微升过氧化氢、PIP、Luminol和0.05%的Tween-20，分别放入到发光检测仪进行检测。

3 实验的结果和分析

3.1 磁微粒的表征

首先需要合成磁微粒，这需要经过两道步骤：首先，需要合成胶体金微粒和四氧化三铁微粒，具体的方法已经在上文中提到，这里不再进行赘述，用有机硅烷这种试剂对四氧化三铁微粒进行修饰，使微粒的表面附着上-SH这一基团；其次，将胶体金微粒和四氧化三铁微粒进行混合反应可以得到平均粒径为3微米左右的磁微粒。磁微粒在制备过程中会存在四种变化状态，具体见图1。

图1 磁微粒在制备过程中的变化图

其中，图中的A反应状态为四氧化三铁的化学微粒，这是通过化学沉淀法制得的；图中的B反应状态为用有机硅烷这种试剂对四氧化三铁微粒进行修饰后的状态；图中的C反应状态为混合反应后生成的磁微粒胶体；图中的D反应状态为经过沉淀借助于组装法得到的磁微粒。

由于胶体金于520nm处的可见光区具有吸收峰，因此把粒径为20纳米左右的胶体金加入到磁微粒中进行反应，通过紫外光的分光光度计分别对胶体金与反应合成后的磁微粒分别进行吸光度的检测，检测结果见图2。

图2 胶体金和合成磁微粒的吸光度

从图上可以看出，随着反应时间的提升，520纳米处的吸光度越来越小，胶体金也越来越小，其纳米粒子都被吸附到了合成磁微粒的表面。此外，在不同的波段、波长处，每个样本吸光度都是不同的，以此来进行区分。通过对比图上给出曲线的共同点可知，吸光度本身的响应曲线非常平坦，只有在特定波长范围才会出现峰值，这样就能够加以利用实现光学的检测。

借助于振动磁强计对合成的磁微粒和四氧化三铁微粒分别进行测量，可以得到图3中的磁滞曲线。

图3 磁滞曲线图

从图中可以看出，合成的磁微粒具备很强的超顺磁性。

3.2 磁微粒表面发光体系性能和固定化的分析

磁微粒的表面有大量的胶体金，蛋白分子能够借助于疏水作用、和磁粒之间的静电作用以及半胱氨酸的残基侧链所具备的巯基作用将抗原分子固定在磁微粒的表面。使用紫外线分光光度计对包被之前的TP抗原和反应后的溶液进行吸光度的测定，可以发现，280纳米处TP抗原有着明显的吸收峰，而反应后的溶液在这点之后几乎没再出现吸收峰，这就说明抗原几乎全部都被包在磁微粒的表面。

4 结语

以上就是基于放光真菌这种测试方法的整个流程，这种方法先将化妆品种的有毒物质转化成为一种稳定检测物，因此具有很强的可靠性和准确性，同时这种方法也比较简单，因此适用于化妆品安全检测这一工作。

[1]张华荣,董国富,雷红宇,等.5种化妆品毒性检测方法的应用评估[J].中国国境卫生检疫杂志，2007,10(04).

[2]郭文秀,孙志,云华,等.化妆品毒性检测方法新进展[J].中国国境卫生检疫杂志,2012,35(06).