不同低氧时间对小鼠肺组织Gremlin mRNA表达的影响

李晓岩

(广州市第一人民医院呼吸内科，广东广州510180)

BMPs调节多种细胞增殖、分化、凋亡。细胞外调节BMPs的结合蛋白，表达能够被精确地调节，可以准确地限定BMP的功能，被看做为BMP内源性拮抗蛋白，他们是一些分泌型多肽(如Follistation、Gremlin、Chordin、Noggin 等)。 其中，Gremlin 是 28-kDa的蛋白，能够结合 BMP4，抑制其与受体结合[1]。Gremlin缺陷的小鼠肾脏缺如和肺间隔缺陷，出生后即死亡[2]。在纤维变性的肺组织，Gremlin过表达弱化BMP4信号，损伤上皮修复，维持TGF-β信号[3]。Gremlin的表达水平与肺纤维化的严重程度负相关[4]。在对低氧的反应方面，相对于其他器官，Gremlin基因在鼠类的肺组织中选择性的表达上调。低氧明显增加Gremlin蛋白的表达，原发性肺动脉高压患者的肺组织Gremlin的表达也显著提高[5]。Gremlin促进大鼠大动脉平滑肌细胞的增殖和迁移[6]。Gremlin在低氧性性肺动脉高压发病机制中的作用尚未阐明，本研究观察不同低氧时间小鼠肺组织中Gremlin mRNA的表达，利用BMP4＋/-C57BL/6J杂合子小鼠肺组织Gremlin mRNA的表达观察其与BMP4的关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物及实验动物分组

BMP4＋/＋C57BL/6J纯合子小鼠和 BMP4＋/－C57BL/6J杂合子小鼠利用genotyping技术进行基因分型。将生后5周的雄性BMP4＋/＋C57BL/6J纯合子小鼠随机分为5组(n＝3或4):即正常对照组、低氧1天组、低氧3天组、低氧7天组和低氧21天组。6只雄性BMP4＋/－C57BL/6J杂合子小鼠随机分成正常对照组和低氧1天组。将低氧小鼠置于低氧装置内，调节箱内氧浓度为10%，每天24 h持续低氧。对照组小鼠除吸入空气外，其它饲养条件与实验组相同。

1.2 小鼠肺组织RNA的提取

低氧完成后，麻醉小鼠取出心肺组织，左肺储存于－80℃冰箱备用，右肺组织提取总RNA，肺组织100 mg加入1ml TRIzol(美国Promega)，利用匀浆仪将组织彻底打碎，放置5 min；加0.2 mL氯仿剧烈震荡离心管15 s，放置2－3 min；4 ℃下12 000 ×g离心15 min后转移水相到新的离心管中，加入0.5 mL的异丙醇沉淀RNA，放置10 min后4℃，12 000×g离心10 min。RNA在管底和侧面形成胶样片状沉淀，移去上清加入1 mL 75%酒精洗涤RNA，涡旋混合物4°C，7，500×g离心 5 min；短暂干燥 RNA 胶样片状沉淀，用 RNase-free水溶解RNA(DNA-freeTMkit:Applied Biosystems公司)

1.3 实时荧光定量PCR检测Gremlin mRNA的测定

Primer3软件设计 Gremlin的引物序列，mGremlin1L 引物 5′GACAAGGCTCAGCACAATGA 3′； mGremlin1R 引 物 5′ACTCAAGCACCTCCT CTCCA-3′利用逆转录反应合成第一条cDNA(Bio-Rad Laboratories，Carlsbad，CA)，利用 iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad Laboratories)进行实时荧光定量PCR检测，Gremlin mRNA扩增值利用Pfaf方法计算[7]。

1.4 数据分析

实验数据均以±s表示。用SPSS 10.0软件进行统计学处理，组间比较用方差分析。

2 结 果

2.1 实时荧光定量PCR检测低氧对Gremlin mRNA的表达

以MCPB为内参照，FQ-PCR标准曲线的扩增效率为98.5%，相关系数为0.992，融解曲线只有单峰出现。标准曲线的相关系数(＞0.985)及扩增效率(90%－120%)判断所得数据的可信。Gremlin mRNA的表达随小鼠缺氧的时间呈先上升后下降的趋势，低氧第一天，低氧第三天，低氧第七天表达分别增加2.8倍、1.9倍、2.2倍(P＜0.05)，低氧 21天时，Gremlin的表达明显低于正常氧组，仅有其的1/4(P＜0.05)见表1，图 1。

表1 低氧对拮抗蛋白Gremlin mRNA表达的影响(±s)

表1 低氧对拮抗蛋白Gremlin mRNA表达的影响(±s)

注:与正常组比较，∗P＜0.05

Nor(n＝3) 1±0 Hy 1 d(n＝3) 2.8±0.3∗Hy 3 d(n＝3) 1.9±0.19∗Hy 7 d(n＝4) 2.2±0.49 Hy 21 d(n＝3) 0.26±0.23∗

图1 低氧对Gremllin mRNA表达的影响

2.2 实时荧光定量PCR检测

正常氧状态下，BMP4＋/＋C57BL/6J纯合子小鼠和 BMP4＋/-C57BL/6J杂合子小鼠肺组织内Gremlin mRNA的表达无明显差异(P＞0.05)。BMP4＋/-C57BL/6J杂合子小鼠常氧1天组Gremlin mRNA相对表达量为(0.92±0.06)和低氧1天组Gremlin mRNA相对表达量为(1.04±0.34)差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2，图2。

表2 BMP4＋/＋C57BL/6J纯合子小鼠和BMP4＋/-C57BL/6J杂合子小鼠肺组织内Gremlin mRNA表达情况(±s)

表2 BMP4＋/＋C57BL/6J纯合子小鼠和BMP4＋/-C57BL/6J杂合子小鼠肺组织内Gremlin mRNA表达情况(±s)

注:与杂合子正常氧组比较，∗P＜0.05

纯合子正常氧 1±0杂合子正常氧 0.92±0.06杂合子低氧一天 (1.04±0.34)∗

图2 BMP4＋/＋C57BL/6J纯合子小鼠和BMP4＋/-C57BL/6J杂合子小鼠肺组织内Gremlin mRNA表达

3 讨 论

BMPs内源性拮抗蛋白可调节BMPs信号系统，调节多种细胞增殖、分化和凋亡[7，8]。Gremlin作为BMPs内源性拮抗蛋白可与BMP4绑定，阻断BMP4与受体的相结合从而影响 BMPs信号系统[9]。BMP4和Gremlin在组织中表达的平衡状态决定了BMP4信号通路的水平和细胞的周期。Gremlin过表达增加了动脉平滑肌细胞的增殖和迁移，在血管损伤的病理生理机制方面也具有重要的作用。

在我们的研究中，选用了BMP4＋/＋C57BL/6J纯合子小鼠和BMP4＋/-C57BL/6J杂合子小鼠作为动物模型，研究在不同低氧时间下肺组织内Gremlin的mRNA表达变化。在肺组织中Gremlin mRNA随低氧时间发生变化，这说明在肺组织中Gremlin的mRNA表达与低氧确实具有相关性。在我们的实验中，低氧21天时，Gremlin的mRNA表达甚至低于基线，然而，一些研究表明低氧21天时BMP4的表达达到高峰，35天才逐渐下调[10]，同时，正常氧条件下及低氧一天状态下，与BMP4＋/＋C57BL/6J纯合子小鼠相比，BMP4＋/-C57BL/6J杂合子小鼠肺组织中Gremlin的mRNA表达无明显变化，说明很可能与非BMP4的BMPs内源性拮抗蛋白相关存在相关性。因此，尚需进一步的研究证实。

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