降解大豆皮纤维优势复合菌群筛选及产品营养价值评定

张开磊，王宝维*，葛文华，张名爱，岳斌，王超，李兆祥

（1.青岛农业大学优质水禽研究所，国家水禽产业技术体系营养与饲料功能研究室，山东青岛266109；2.山东嘉冠粮油工业集团有限公司，山东济宁272000）

降解大豆皮纤维优势复合菌群筛选及产品营养价值评定

张开磊1，王宝维1*，葛文华1，张名爱1，岳斌1，王超1，李兆祥2

（1.青岛农业大学优质水禽研究所，国家水禽产业技术体系营养与饲料功能研究室，山东青岛266109；2.山东嘉冠粮油工业集团有限公司，山东济宁272000）

试验以大豆皮为试验材料，采用复合菌种进行发酵，以便筛选出大豆皮饲料最佳优势复合菌群和最佳发酵工艺；同时对产品进行营养价值评定。采用纳豆芽孢杆菌、乳酸菌、产阮假丝酵母菌和草酸青霉F67 4种菌种，通过对菌种、发酵培养基和发酵条件进行筛选，确定大豆皮最佳发酵工艺；并以鹅为试验动物进行代谢试验，评价大豆皮发酵产品的营养价值。结果表明：混合菌种组合发酵显著优于单菌发酵；不同的氮源、无机盐、温度及发酵时间等对发酵效果有显著影响；发酵大豆皮显著改善其营养利用价值，鹅营养利用率显著提高；4种优势复合菌种发酵大豆皮能够显著改善其营养利用价值，提高产品营养利用率。

大豆皮；纤维素；菌种筛选；发酵工艺；营养利用率

大豆皮是大豆制油工艺的副产品,我国每年生产约1 000万～1 200万t。然而,由于大豆皮蛋白质含量低,纤维素含量高,直接在饲料中使用营养利用率很差；且其含有大量的脲酶、胰蛋白酶抑制因子等抗营养因子,目前在畜禽利用上受到了一定的限制［1］。迄今为止,国内外对大豆皮没有进行更加科学地商品化利用,只是将大豆皮简单地作为粗饲料部分代替常规饲料应用于动物生产中,利用效果不够理想。在微生物发酵饲料方面,对于去皮豆粕发酵研究较深,而对于微生物发酵大豆皮没有进行系统化的研究,大豆皮迄今品质改良也没有满意的方法。如周旭等［2］采用3种益生菌发酵大豆皮,虽然在一定程度上提高了粗蛋白(CP)含量,但却无法有效的降解大豆皮中粗纤维(CF),因此商品化利用受到一定的限制。为此,本试验通过大豆皮发酵菌种、培养基的筛选和发酵工艺的优化,确定发酵大豆皮的最佳条件,旨在提高大豆皮中粗蛋白水平,降低大豆皮中粗纤维的含量,降解大豆皮中脲酶活性,提高发酵产品营养利用价值。另外,通过代谢试验对发酵大豆皮饲料营养价值进行评定,以便更好地进行产品的开发和利用。

1 材料与方法

1.1 材料菌种和大豆皮纳豆芽孢杆菌、产阮假丝酵母菌和乳酸菌,购自中国微生物菌种保藏中心, F67(草酸青霉)由青岛农业大学优质水禽研究所从鹅肠道中分离获得,已经过中国科学院微生物研究所鉴定为草酸青霉并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(微生物保藏编号：CGMCC No.2260)；大豆皮由山东嘉冠粮油工业集团有限公司提供,其粗纤维(CF)含量38.00%、粗蛋白(CP) 10.00%、钙0.53%、磷0.18%、脲酶活性为0.7 U/g；麸皮市售,粗纤维含量为8.90%、粗蛋白11.95%、钙0.11%、磷0.83%。试验鹅由国家水禽产业技术体系示范基地莱阳天森豁眼鹅繁育中心提供。发酵大豆皮经农业部饲料监督检测中心证明安全无毒。

1.2 试验方法

1.2.1 大豆皮发酵菌种的筛选将4个菌株双菌混合和多菌混合分别接入固态大豆皮发酵培养基中,菌种组合为1+2、1+3、1+4、2+3、2+4、3+4、1+2+3、1+ 2+4、1+3+4、2+3+4、1+2+3+4(1代表草酸青霉、2代表乳酸菌、3代表纳豆芽孢杆菌、4代表产阮酵母菌)进行固态发酵试验,测定产物中营养物质的含量。

1.2.2 大豆皮发酵菌种的设计将扩增好的草酸青霉、乳酸菌、纳豆芽孢杆菌、产阮假丝酵母菌菌液分别用无菌水稀释到1×107个/mL,分别接种到单一大豆皮发酵培养基上,同时将4个菌株混合根据［3］研究将4个菌种按比例2∶1∶2∶1(F67×2∶乳酸菌×1∶纳豆芽孢杆菌×2∶产阮酵母菌×1,菌种数量比为1×107个/ mL∶1×107个/mL∶1×107个/mL∶1×107个/mL)接种到培养基中,确定最佳的接种量,进行固态发酵试验,测定产物中营养物质的含量。

1.2.3 固态发酵培养基的设计设计分组为麸皮5%、大豆皮95%、麸皮10%、大豆皮90%；麸皮15%、大豆皮85%、麸皮20%、大豆皮80%。进行固态发酵试验,测定产物中营养物质的含量。

1.2.4 不同氮源和添加量的设计将尿素、硫酸铵、硝酸铵和草酸铵4种氮源,每种设4个水平的添加量,其添加量分别为1.0%、1.5%、2.0%和2.5%,进行固态发酵试验,测定产物中营养物质的含量。

1.2.5 不同无机盐和添加量设计将磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化钙(CaCl2)、碳酸钙(CaCO3)作为无机盐其添加量为0.1%、0.2%、0.3%,进行固态发酵试验,测定产物中营养物质的含量。

1.2.6 大豆皮发酵料水比的设计在不考虑大豆皮饲料(大豆皮+辅料)本身的含水量的基础上,调节料水比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5(及分别加蒸馏水为25、16.66、12.5、10、8.33 mL),设定培养温度为30℃,发酵72 h后测定产物中营养物质的含量。

1.2.7 大豆皮饲料发酵温度的设计根据筛选的适宜的接种量及料(大豆皮+辅料)水比设定温度为25、30、35、40、45℃,发酵72 h后测定产物中营养物质的含量。

1.2.8 大豆皮饲料发酵时间设计根据筛选的适宜的接种量、料(大豆皮+辅料)水比和温度设定培养时间分别为24、36、48、60、72、84 h,测定产物中营养物质的含量。

1.2.9 发酵大豆皮饲料营养利用率采用12周龄五龙鹅进行消化代谢试验。试验设计2个组,每个组3个重复,每个重复6只鹅；试验组饲喂发酵大豆皮饲料(含辅料),对照组饲喂未发酵大豆皮饲料(含辅料),试验阶段预试期4 d,禁食1 d,正试期3 d,自由饮水。

1.3 测定的指标与方法发酵产物中粗蛋白(CP)采用Sweden生产的FOSS TECATOR QUALITY ASSURANCE设备进行检测；真蛋白采用硫酸铜法测定；脲酶活性采用滴定法测定。粗纤维(CF)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)采用ANKOM公司生产的ANKOM2000 FiberAnalyzer(NY14450)设备进行检测；钙(Ca)采用乙二胺匹乙酸二钠(EDTA)络合滴定法进行测定；磷(P)采用BioSpec-1610核酸蛋白测定仪以比色法进行检测；小肽利用三氯乙酸氮溶指数法(TCA-NSI)进行测定。

1.4 统计分析用SAS统计软件进行统计分析。显著性检验采用LSD法多重比较,P＜0.05和P＜0.01分别为差异显著和极显著水平,P＞0.05表示差异不显著。试验数据均以平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 不同单一菌种对大豆皮发酵效果的影响由表1可知,与对照组相比4个菌种均能显著提高CP含量(P＜0.05)；显著降低CF含量(P＜0.05)；NDF的含量F67降低幅度最大极显著低于对照组(P＜0.01),乳酸菌组差异不显著(P＞0.05),其他均显著低于对照组(P＜0.05)；ADF含量产阮酵母菌组降低幅度最大,极显著低于对照组(P＜0.01),其他均显著低于对照组(P＜0.05)。结果表明,4个菌种均具有提高大豆皮中粗蛋白水平、降低纤维素含量的作用。

表1 单菌固态发酵试验产物的粗蛋白及纤维含量%

2.2 菌种组合对大豆皮发酵效果的影响由表2可知,三菌发酵,CP含量显著高于双菌发酵(P＜0.05),4个菌种发酵效果显著高于双菌发酵(P＜0.01),显著高于3个菌种发酵(P＜0.05)；CF含量以4个菌种组最低,极显著低于双菌发酵(P＜0.01),显著低于3个菌种发酵(P＜0.05)；NDF和ADF的含量呈现和CF含量一致的趋势。结果表明,4个菌种组合发酵大豆皮效果最佳。

表2 混合菌株固态发酵试验产物的粗蛋白及纤维含量%

2.3 固态发酵培养基对大豆皮发酵效果的影响由表3可知,添加麸皮组能显著提高发酵大豆皮中CP含量,提高发酵效果,当麸皮的添加量为10%时,纤维素降解幅度最大；经混合发酵后大豆皮饲料(辅料)和发酵单一大豆皮相比蛋白质含量提高19.80%,粗纤维含量降低17.24%。

2.4 无机氮源的不同添加量对发酵产物中蛋白及纤维含量的影响由表4可知,在固态发酵试验中,尿素、氯化铵、草酸铵、硝酸铵这4种氮源加入均可以提高发酵产物真蛋白的含量；但在添加量一致的情况下,尿素、氯化铵对发酵产物的真蛋白含量极显著高于其他各组(P＜0.01)。当尿素和氯化铵添加量为2.0%时发酵产物的真蛋白含量最高,含量提高了68.13%,极显著高于其他各组(P＜0.01),NDF、ADF和CF的含量最低,极显著低于其他各组(P＜0.01)。表明,最佳的氮源为尿素和氯化铵,且添加量为2.0%。

表3 不同的发酵底物对发酵产物中粗蛋白及纤维含量的影响%

表4 无机氮源不同添加量对发酵产物中蛋白及纤维含量的影响%

2.5 无机盐对发酵产物中粗蛋白及纤维含量的影响由表5可知,0.2%的Na2HPO4和0.3%的K2HPO4的添加效果最好,CP含量极显著高于其他各组(P＜0.01),NDF、ADF和CF的含量极显著低于其他组(P＜0.01),2组之间差异不显著(P＞0.05)。Ca化合物的添加同样能提高发酵产物的CP,在等添加量的情况下,碳酸钙组CP含量显著高于氯化钙组(P＜0.05)；NDF、ADF和CF的含量显著低于碳酸钙组(P＜0.05)。其他无机盐均能提高发酵底物中CP含量,降低NDF、ADF和CF的含量。结果表明,无机盐对大豆皮的发酵有显著促进作用,Na2HPO4、K2HPO4及CaCO3适宜添加比例分别为0.3%、0.2%和0.3%。

2.6 料水比对发酵产物中粗蛋白及纤维含量的影响由表6可知,随着料(大豆皮+辅料)水比的增加,CP含量先增加后降低,当料水比为1∶3时发酵产物的粗蛋白含量达到最高,极显著(P＜0.01)高于其他各组；CF的含量最低,极显著(P＜0.01)低于其他各组；NDF和ADF含量也是最低,显著(P＜0.05)低于料水比为1∶2和1∶5,极显著(P＜0.01)低于其他各组。根据试验结果,并考虑到后期烘干成本,可选择1∶3作为发酵适宜的料水比。

2.7 温度对发酵产物中粗蛋白及纤维含量的影响由表7可知,随着温度的升高,发酵产物的粗蛋白含量逐渐升高,当温度达到30℃时CP最高含量为15.25%,极显著高于其他温度条件的含量(P＜ 0.01),NDF、ADF、CF含量最低分别为36.15%、29.69%、22.00%,显著低于其他各组(P＜0.05)；但继续升高温度,粗蛋白含量反而有所下降,说明复合菌种发酵适宜温度为30℃。

表5 无机盐对发酵产物中粗蛋白及纤维含量的影响%

表6 料水比对发酵产物中粗蛋白及纤维含量的影响%

表7 温度对发酵产物中粗蛋白及纤维含量的影响%

2.8 发酵时间对发酵产物中粗蛋白及纤维含量的影响由表8可知,随着发酵时间的增长,发酵产物中CP呈现先上升后下降的趋势,当发酵时间为72 h时,CP含量到达最高,显著高于其后发酵时间时的含量(P＜0.05),极显著高于72 h之前发酵时间时的含量(P＜0.01)；虽然随着发酵时间的延长NDF、ADF、CF的含量一直在下降,而CP含量也在下降,表明,发酵时应选择合适的发酵时间且以72 h为宜。

2.9 发酵大豆皮饲料营养利用率由表9可知,发酵后大豆皮饲料营养成分发生了显著变化,CP含量特别是小肽含量显著升高,CF、NDF和ADF极显著降低,脲酶活性为0。由表10可知,发酵大豆皮CP、CF、NDF和ADF的利用率极显著高于未发酵大豆皮(P＜0.01),与于未发酵大豆皮饲料比较,发酵大豆皮饲料CP、CF、ADF及NDF利用率分别提高了22.24%、30%、7.44%和5.7%；Ca利用率提高了2.79%(P＞0.05)；P的利用率提高了13.33%(P＜0.05)；大豆皮饲料发酵(含辅料)后小肽利用率高达99.73%。表明发酵使大豆皮饲料(含辅料)品质得到明显改善,养分利用率也得到了提高。

表8 发酵时间对发酵产物中粗蛋白及纤维含量的影响%

表9 发酵前后营养物质比较

表10 发酵前后营养物质利用率比较%

3 讨论

3.1 菌种选择对大豆皮发酵的影响姜晓霞等［3］研究表明,F67产的果胶酶能提高机体对饲料中纤维、蛋白质、钙、磷等营养物质的利用率；张名爱等［4］研究表明,草酸青霉能够产生纤维素酶和果胶酶；文少白等［5］研究表明,纤维素酶和果胶酶能改善细胞壁成分的消化性,破坏组织结构；付弘贇等［6］研究表明,芽孢杆菌和乳酸菌能降解豆粕中的抗营养因子,促进动物对营养物质的消化吸收；陈兵等［7］研究证实,纳豆芽孢杆菌能提高动物的生长性能和营养利用率；叶丙奎［8］研究表明,芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌能利用糖类物质迅速增殖,基质中的无机氮被利用而转化为菌体自身的有机氮(蛋白质),从而使基质物料的真蛋白质水平大大提高。龙方羽等［9］利用草酸青霉(F67)等微生物发酵秸秆研究结果表明,饲料中的真蛋白含量提高了136%,CP含量提高了148%；由此可见,发酵饲料中蛋白质含量的提高是微生物作用的结果。上述研究表明,草酸青酶、纳豆芽孢杆菌、乳酸菌和产阮假丝酵母菌均具有益生作用。

本试验选择的上述4种发酵菌种,其中F67能够将大豆皮中的纤维素降解为单糖供其他3个菌种利用,同时将大豆皮细胞壁降解,将细胞内营养物质析出,为后续菌种利用提供条件；纳豆芽孢杆菌能够降解大豆皮中主要的抗营养因子(脲酶),同时具有清香味,赋予产品特殊的味道；产软假丝酵母菌能够利用F67产生的单糖快速生长,并将添加的基质中的无机氮彻底利用而转化为菌体自身的有机氮(蛋白质),这是蛋白质含量提高的主要原因；以上3个菌种的生长可以消耗大量的氧,维持发酵过程中的厌氧环境进而为乳酸菌生长提供条件,乳酸菌在生长过程中产生乳酸,与纳豆芽孢杆菌一起共同赋予大豆皮产品清酸香味。以上4个菌种相互促进,又相互拮抗,复合发酵能够显著增加大豆皮中营养物质含量、提高动物适口性与营养利用率、降解大豆皮有毒有害物质和对动物生产具有益生作用。关于微生物复合发酵协同作用机理有待于继续研究。

3.2 发酵培养基对大豆皮发酵的影响本试验选用大豆皮是不溶性的碳水化合物,属于中能量低蛋白质粗饲料,其自身的含氮物质很少。麸皮中含有丰富的维生素和矿物质,能够调节发酵基质的营养,它还是一种很好的膨松剂,同时也可作为辅助氮源［10］。本试验结果表明,当尿素添加量超过2.0%时,虽然真蛋白含量略有提高,但尿素残留量也随之明显上升,发酵产物有明显的刺鼻性气味,影响产品的质量。从经济及生产实践的角度考虑,虽然氯化铵能显著提高真蛋白含量,但价格较贵,在实际生产中可选择1.5%尿素为发酵氮源。

在本试验中0.2%的Na2HPO4的添加效果最好, CP含量较其他组含量最高；添加0.2%CaCI2和0.3%的CaCO3可以使发酵产物中的CP含量提高至15.85%和13.07%,但CaCl2的效果不如CaCO3。在实际生产中,碳酸钙效果成本都优于氯化钙,综合考虑以上情况,确定大豆皮发酵饲料中较合适的无机盐为0.2%的Na2HPO4和0.3%碳酸钙。

3.3 发酵工艺对大豆皮发酵效果的影响王龙昌等［11］研究表明,微生物活性与水分含量成正相关, Kanekar等［12］利用乳酸菌发酵豆粕,取得了同样的研究结果。本试验结果表明,在料(大豆皮+辅料)水比为1∶3的时候,发酵效果最佳,此时CP含量为15.59%达到较高的水平。这表明料水比为1∶3时,发酵底物所含水分适合发酵,适合菌种的生长。

由于混合发酵涉及4种不同菌种的共同生长,因而选择合适的发酵温度,平衡各个微生物之间的生长繁殖,对发酵产物的质量有着十分重要的影响［13］。在本试验中,在温度为30℃时CP含量到达最高为15.25%。过高的温度可使蛋白质初步变性,造成微生物体内的酶活性降低和微生物繁殖速度减慢,从而使菌体蛋白合成量减少。但在实际生产中应根据生产条件,合理调节发酵时间。

3.4 大豆皮饲料(含辅料)发酵对营养利用率的影响Puniya等［14］研究表明,发酵豆粕中真蛋白含量显著提高；周伏忠等［15］研究表明,发酵豆粕产物中小分子蛋白肽含量显著增加,并且能够显著提高肉鸡的营养利用率。本试验中,大豆皮经过发酵后(含辅料)菌体蛋白含量增加,各种氨基酸搭配合理、种类齐全,原料中不易被畜禽吸收利用的各类植物大分子物质被分解成利于动物吸收的小分子营养物质,提高了发酵大豆皮饲料(含辅料)的利用率,使原来营养价值较低的大豆皮,转化为营养全面、更易于吸收的生物蛋白饲料,从而提高喂养对象的生产能力和畜产品质量。

4 结论

采用4个优势复合菌种发酵单一大豆皮,与未发酵的大豆皮比较,CP含量提高了23.52%,CF含量降低了24.94%,脲酶含量为0。与单菌发酵大豆皮结果比较,CP含量提高19.11%,CF含量降低12.53%。结果表明混合菌种发酵效果优于单菌发酵。

采用优势复合菌种发酵大豆皮饲料(含辅料),与未发酵大豆皮饲料(含辅料)比较,发酵大豆皮饲料的CP含量提高了46.20%,CF、ADF及NDF分别降低了39.51%、39.32%和46.25%,脲酶含量为零,真蛋白含量提高了68.13%,特别是小肽含量达到2.13%。结果表明大豆皮配方(含辅料)发酵,优于大豆皮单一发酵,能够有效地改变了大豆皮营养成分。

辅料培养基中麸皮最适添加量为10%；最佳氮源为尿素,添加量为1.5%；最佳无机盐为磷酸氢二钠和碳酸钙,其添加量分别为0.2%和0.3%。

与于未发酵大豆皮饲料(含辅料)比较,发酵大豆皮饲料(含辅料)的CP、CF、ADF及NDF利用率分别提高了22.24%、30%、7.44%和5.7%,Ca利用率提高了2.79%,P的利用率提高了13.33%；小肽利用率高达至99.73%。结果表明,发酵大豆皮饲料(含辅料)营养利用率得到明显改善,属于优质生物饲料。

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S835.5

A

0258-7033（2015）09-0042-06

2014-05-09；

2014-11-14

国家水禽产业技术体系专项基金（CARS-43-11）；青岛市科技支撑计划项目（12-1-3-17-nsh）

张开磊（1988-），男，山东日照人，硕士研究生，从事动物营养与保健研究，E-mail：zklc311@163.com

* 通讯作者：王宝维，教授，研究生导师，E-mail：wangbw@qau.edu. cn