传统自然发酵四川香肠加工贮藏过程中生物胺含量变化*

孙霞，巩洋，杨勇，曾建华，方秋艳，万重，杨敏，卿丹丹，李跃文

(四川农业大学食品学院，四川雅安，625014)

生物胺(Biogenic amines，BA)是由氨基酸脱羧或醛和酮氨基化形成的具有生物活性的小分子量含氮有机化合物［1］。按组成成分的不同，可将生物胺分为单胺(组胺、酪胺、色胺、苯乙胺等)、二胺(尸胺、腐胺等)和多胺(精胺和亚精胺等)这三类［2］。适量的生物胺可以增强代谢活力、促进生长、增强肠道系统免疫活性、消除自由基和控制血压等，并在神经系统中发挥活性作用［3］。过量的生物胺不仅会影响产品的风味，而且会对人体健康造成危害，导致高血压、腹部痉挛和腹泻等，引起人体心脏和中枢神经系统等器官的损害［4-5］。富含蛋白质的发酵肉制品、鱼类和发酵豆制品由于易被微生物侵染而可能具有高浓度的生物胺［6-8］。目前应用于生物胺的检测方法较多，主要包括高效液相色谱法、气质联用、薄层色谱法、毛细管电泳和生物传感器法［9-11］。

传统四川香肠主要利用自然发酵，发酵微生物来源于环境中混入的杂菌和肉中有益菌与杂菌竞争形成的优势菌群［12］，这些微生物可能具有氨基酸脱羧酶活性，导致四川香肠中的氨基酸脱羧形成生物胺。De Mey等［13］研究发现，干发酵香肠中腐胺、尸胺和组胺的含量在保质期的时间内未超过FDA的标准。Gardini等［14］研究发现成熟120天的发酵香肠中酪胺、腐胺和尸胺的含量分别为165.55、22.87和52.90 mg/kg。目前对传统自然发酵的四川香肠中生物胺的种类和含量的研究均较少。因此，测定传统自然发酵的四川香肠加工过程中生物胺的含量具有十分重要的意义，本文以高效液相色谱法对其进行测定，期望为传统自然发酵的四川香肠中生物胺的安全评估提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺的标准品以及衍生剂丹磺酰氯均购于美国Sigma公司;乙腈和丙酮为色谱纯;高氯酸、氨水、NaOH、Na2CO3等均为分析纯，购于成都化工试剂有限公司;超纯水为实验室自制。

ST16R高速冷冻离心机，北京博仪恒业科技发展有限公司;HWS24电热恒温水浴锅，上海一恒公司;BMS602型均质机，德国BRT公司;微型漩涡混合仪上海沪西分析仪器厂;海尔冰箱;电子天平;高效液相色谱仪(岛津 LC-2010CHT);超声波清洗器(KH5200B型);超纯水仪(Milli-Q，Millipore)。

1.2 传统自然发酵四川香肠的制作

工艺配方:猪肉100 kg(皮下脂肪20 kg，瘦肉80 kg)，食盐 2.5 kg，辣椒粉1.0 kg，花椒粉 0.4 kg，白砂糖1.0 kg，味精 0.15 kg，白酒 1.0 kg，十三香 0.05 kg，NaNO30.025 kg，NaNO20.007 5 kg。

工艺流程:原料肉→预处理→绞碎→添加配料→搅拌→腌制(4℃，4 h)→灌肠→自然晾挂(温度为8～15℃，相对湿度为75% ～90%)→成品

1.3 实验方法

1.3.1 生物胺标准溶液的配制

准确称取色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺和亚精胺各50 mg，用0.4 mol/L HClO4定容到50 mL，在4℃冰箱避光保存。分别吸取各生物胺单组分标准储备溶液，置于10 mL容量瓶中，用0.4 mol/L HClO4分别稀释制成浓度分别为:0.5、1.0、2.5、5.0、10、20 μg/mL的混合标准溶液，在4℃冰箱避光保存。

1.3.2 生物胺标准品的衍生

参照胡鹏等［8］的方法，略作修改。取1 mL的标准品混合溶液，加入200 μL 2 mol/L NaOH使之呈碱性，再加入300 μL饱和NaHCO3溶液进行缓冲，加入2 mL 10 mg/mL丹磺酰氯丙酮溶液，在40℃下处于黑暗中反应45 min后加入100 μL的NH4OH终止反应，在室温下暗反应30 min，去除残留的丹磺酰氯溶液，加入乙腈使终体积为5mL。衍生处理后0.22 μm滤膜过滤，用于分析检测。

1.3.3 样品处理

取5 g香肠加入20 mL 0.4 mol/L HClO4，匀浆机上彻底匀浆，冷冻离心机(4℃，4 000 r/min)离心10 min，沉淀部分如前的方法再重新提取1次。取2次的上清液用0.4 mol/L HClO4定容到50 mL，取1 mL的样液如标准溶液一样进行柱前衍生。

1.3.4 色谱条件

色谱柱为 C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流速 1 mL/min，紫外检测波长 254 nm，进样量 10 μL，柱温30℃，流动相A为水，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱程序，洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.3.5 数据处理与统计分析

所有测定结果均为3次以上重复测定的平均值，使用Excel 2007和SPSS17.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 生物胺标品图谱及标准曲线

图1是生物胺混合标准样品的色谱图。由图1可知，本实验所采用的HPLC方法可将溶剂峰及杂质峰在前5 min内全部洗脱出。而7种生物胺:色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺及亚精胺能在20 min内有效分离，采用该方法来分离生物胺具有较好的分离效果。从表2可以看出，7种生物胺的峰面积与其相应的浓度分别呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999，通过该方法可准确测定出生物胺的含量。

图1 生物胺混合标品HPLC色谱图Fig.1 The HPLC chromatogram for a standard mixture of biogenic amines

表2 七种生物胺回归方程及相关系数Table 2 Regression equations and correlation coefficients of seven biogenic amines

2.2 传统自然发酵四川香肠中生物胺含量

传统自然发酵四川香肠加工贮藏过程中生物胺含量变化见表3。原料肉中只检测出了色胺、苯乙胺和亚精胺，这可能是由于原料肉中缺少了能够产生氨基酸脱羧酶的微生物，导致生物胺的含量较少。有研究表明原料肉会影响生物胺的形成，Bover-Cid等［15］研究发现用经4℃、5天处理的原料肉做的发酵香肠中的生物胺比经-20℃、5天处理的原料肉形成更早且含量更高。亚精胺被认为是原料肉中常见的生物胺，Komprda等［16］发现亚精胺的含量不会受到发酵剂菌种和发酵时间以及发酵温度的影响。

传统自然发酵四川香肠加工贮藏过程中检测出的单胺有色胺、苯乙胺、组胺和酪胺，色胺是由色氨酸经过氨基酸脱羧作用形成的，其含量由原料肉的5.12 mg/kg增加到33.16 mg/kg，这与 Komprda等［17］研究发酵剂、贮藏时间和温度对干发酵香肠中生物胺的含量影响的结果不一致，这可能是由于其在发酵前期较高的温度导致蛋白质的降解，增加了色胺的积累。Suzzi［18］等发现发酵香肠中色胺含量低于30 mg/kg，传统自然发酵四川香肠在加工贮藏前期也一直低于这个含量，但贮藏90 d后色胺超过30 mg/kg。苯乙胺由原料肉的1.77 mg/kg增加到22.12 mg/kg。有研究表明，发酵食品中苯乙胺含量在30 mg/kg以上就可对人体构成潜在的危险，传统自然发酵四川香肠在加工贮藏过程中一直低于30 mg/kg，说明苯乙胺含量在安全范围之内。组胺由未检出增加到127.90 mg/kg，组胺是生物胺中毒性最大的生物胺，美国食品药品监督局规定了水产品中组胺含量不得超过50 mg/kg，上海市食品药品监督管理局于2011年发布上海市地方标准《食品安全地方标准发酵发酵肉制品(征求意见稿)》，对比国内外相关标准，暂定发酵肉制品中组胺限量为低于200 mg/kg［19］，传统自然发酵四川香肠在成熟前期(0～20 d)未超过50 mg/kg，在加工贮藏过程中未超过200 mg/kg。酪胺由未检出增加到153.06 mg/kg，酪胺是毒性仅次于组胺，Latorre-Moratalla等［20］发现酪胺是欧洲传统发酵香肠中含量最多的生物胺，酪胺含量最高达到773.43 mg/kg，有学者指出酪胺含量超过100 mg/kg会对人体健康造成不良影响［21］，传统自然发酵四川香肠加工贮藏前期(0～70 d)未超过100 mg/kg。

腐胺和尸胺是传统自然发酵四川香肠加工贮藏过程中检测出的二胺，腐胺由未检出增加到92.83 mg/kg，尸胺由未检出增加到132.46 mg/kg，腐胺和尸胺等二胺与其他胺(色胺、苯乙胺、组胺和酪胺)不同，它们本身的毒性较小，但是它们能抑制组胺、酪胺代谢酶和羟甲基转换酶的活性，从而增加组胺和酪胺的毒性;此外还可以与食物中的亚硝酸盐反应产生致癌物质亚硝胺。腐胺在传统自然发酵四川香肠加工贮藏过程中未超过100 mg/kg，而尸胺在加工贮藏前期(0～70 d)未超过100 mg/kg。

亚精胺是传统自然发酵四川香肠加工贮藏过程中检测出的多胺，且亚精胺的含量范围在1.24～3.12 mg/kg，在整个加工贮藏过程中亚精胺的含量变化不显著，这与Komprda等［17］的研究结果相似，即亚精胺的含量在加工贮藏过程中通常保持相对恒定，而与王桂瑛等［22］对火腿加工过程中生物胺的变化的研究结果不一致，这可能是由于香肠的加工工艺与火腿间存在差异。

在传统自然发酵四川香肠贮藏120 d时，色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺和亚精胺以及生物胺总量分别为:33.16、22.12、92.83、132.46、127.90、153.06、3.12 和 564.64 mg/kg。Eerola 等［23］认为，血管活性生物胺(色胺、苯乙胺、组胺和酪胺)的总量低于20 mg/100 g是发酵肉制品具有较高品质的指标之一，传统自然发酵四川香肠中血管活性生物胺含量均低于20 mg/100 g。在传统自然发酵四川香肠整个加工贮藏过程中生物胺总量呈明显增加的趋势(P＜0.01)，Santos［24］认为生物胺总量超过1 000 mg/kg 会对人体健康产生极大威胁，传统自然发酵四川香肠中生物胺总量远低于1 000 mg/kg。

表3 传统自然发酵四川香肠加工贮藏过程中生物胺含量 单位:mg/kgTable 3 Content of biogenic amines in traditional natural fermentation Sichuan-style sausage during processing and storage

3 结论

在传统自然发酵四川香肠加工贮藏过程中，原料肉中只检测出了色胺、苯乙胺和亚精胺，贮藏120 d检测出了7种生物胺，除亚精胺外，6种生物胺(色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺和酪胺)的含量在加工贮藏过程中均显著增加(P＜0.01)。传统自然发酵四川香肠中主要以酪胺、组胺、尸胺和腐胺为主，含量分别达到 153.06、127.90、132.46 和 92.83 mg/kg，4种生物胺占生物胺总量的89.66%。传统自然发酵四川香肠中血管活性生物胺(色胺、苯乙胺、组胺和酪胺)含量均低于20 mg/100 g。生物胺总量在加工贮藏过程中变化显著(P＜0.01)，总量低于1 000 mg/kg。有学者建议发酵香肠中各种生物胺含量应低于100 mg/kg，传统自然发酵四川香肠在加工贮藏前期(0～70 d)各种生物胺含量均低于100 mg/kg，在贮藏后期(70～120 d)尸胺、组胺和酪胺的含量超过100 mg/kg，因此为保障传统自然发酵四川香肠的安全，需对其贮藏后期生物胺的控制进行进一步研究。

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