熟眠胶囊对失眠模型大鼠脑内不同组织5-HT1a、5-HT2a受体表达的影响

熟眠胶囊对失眠模型大鼠脑内不同组织5-HT1a、5-HT2a受体表达的影响

王冰梅1，许峰2，王中男2*

(1.长春中医药大学基础医学院，长春 130117；2.长春中医药大学第一附属医院，长春 130117)

摘要：目的观察熟眠胶囊对失眠大鼠脑内5-HT1a、5-HT2a受体表达的影响。方法将成年雄性Wistar大鼠60只随机分为正常对照组(N组)、失眠模型组(M组)、地西泮组(D组)、熟眠胶囊高、中、低组(SM-H、SM-M、SM-L组),每组10只，采用腹腔注射PCPA法造模。造模成功后，给药组分别给予熟眠胶囊(28，14，7 g/kg)、地西泮(0.525 mg/kg)，N组、M组给予相应容量的蒸馏水，连续给药7 d,分别观察各组大鼠下丘脑、海马内5-HT1a、5-HT2a受体mRNA表达量的变化。结果与N组相比，M组下丘脑、海马5-HT1a表达量明显降低、5-HT2a表达量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05、P<0.05);与M组相比，D组下丘脑、海马5-HT1a表达量明显升高、5-HT2a表达量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05、P<0.05)；与M组相比，SM-H、SM-M组下丘脑、海马5-HT1a表达量明显升高(P<0.05、P<0.05)、5-HT2a表达量明显降低(P<0.05、P<0.05),差异有统计学意义。结论熟眠胶囊可以通过调节失眠模型大鼠下丘脑、海马中5-HT1a、5-HT2amRNA的表达发挥治疗作用。

关键词：熟眠胶囊；失眠；5-羟色胺1a受体；5-羟色胺2a受体

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.03.022

中图分类号：R256.23文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)03-0286-03

基金项目:吉林省科学技术厅课题(20110930)。

作者简介:王冰梅(1970-)，女，博士，副教授，主要从事中西医结合基础研究。

收稿日期:(责任编辑：张瑞彬2014-02-10)

*通信作者:王中男，电话-(0431)86172503，电子信箱-zhongnanw@sina.com

Effects of Shu-Mian Capsule on 5-HT1a、5-HT2areceptor mRNA expression of

different brain tissue of insomnia rat

WANG Binmei1,XU Feng2,WANG Zhongnan2*

(1.Department of Physiology,College of Basic Medical,Changchun University of TCM,Changchun 130117,China;

2.First Affiliated Hospital of Changchun University of TCM,Changchun 130117,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect of Shu-Mian Capsule on the expression of 5-HT1a and 5-HT2a receptors in Insomnia rats’ brain.MethodsSixty male Wistar rats were randomly divided into control (N group),insomnia model (M group),Diazepam (D group),and high,middle and low dose group of Shu-Mian Capsule groups(SM-H、SM-M、SM-L group respectively),with 10 cases in each,and the insomnia model rats were made by intraperitoneal injection of PCPA.The rats of SM-H、SM-M、SM-L group were subsequently administrated with Shu-Mian Capsule at a dose of 28 g/kg,14 g/kg,7 g/kg respectively,while rats in D group with Diazepam at a dose of 0.525 mg/kg,and rats in M and N groups with the same volume of distilled water.The treatment lasted for 7 days.Then the expression of 5-HT1a and 5-HT2a receptors mRNA in hypothalamus and hippocampus in each rat were investigated.ResultsCompared with the control (N) group,the expression of 5-HT1a mRNA in hypothalamus and hippocampus in rats from M group decreased significantly,while the 5-HT2a mRNA increased significantly(P<0.05,P<0.05).Compared with M group,the expression of 5-HT1a mRNA in hypothalamus and hippocampus in rats from D group increased significantly,while the 5-HT2a mRNA decreased significantly (P<0.05,P<0.05).Compared with M group,the expression of 5-HT1a mRNA in hypothalamus and hippocampus in rats from SM-H and SM-M groups increased significantly,while the 5-HT2a mRNA decreased significantly (P<0.05,P<0.05).ConclusionThe therapeutic effect of Shu-Mian capsule maybe performed by the regulating of the expression of 5-HT1a and 5-HT2a mRNA in the insomnia model rats’ hypothalamus and hippocampus.

Keywords:Shu-Mian Capsule;Insomnia;serotonin 1a receptor;serotonin 2a receptor

失眠可引起人或动物出现疲劳、思维紊乱，常伴不良的情绪变化。5-羟色胺(5-HT)是睡眠调节最为重要的神经递质之一，脑组织内5-HT1a、5-HT2a受体mRNA的表达量可以反映5-HT对睡眠的调节机制。熟眠胶囊在临床上治疗失眠症疗效确切。本实验通过研究熟眠胶囊对失眠模型大鼠下丘脑、海马内5-HT1a、5-HT2a受体mRNA的表达量的影响，探讨其改善睡眠的作用机制。

1实验材料

1.1实验动物成年雄性Wistar大鼠60只，购自吉林大学实验动物中心，合格证号2013A015，体质量180～220 g。动物于实验前1周适应环境，自由进食、饮水。

1.2实验仪器和试剂台式高速冷冻离心机(LECEND MICRO 21R)，Thermo；7500实时荧光定量PCR，美国ABI；PCPA，美国Sigma公司；柱式Trizol总RNA提取试剂盒，上海生工公司；TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix试剂盒，北京全式金公司；PCR引物合成，上海生工公司。

1.3药物熟眠胶囊，由长春中医药大学附属医院制剂室提供；地西泮，江苏济川制药有限公司生产。

2实验方法

2.1分组及造模将Wistar大鼠随机分组为正常组(N组)和实验组,正常组10只，实验组若干只。实验组大鼠腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)(300 mg/kg)，连续2 d，1次/d，正常组每日注射生理盐水。于第1次注射PCPA 48 h后应用阈剂量戊巴比妥钠(40 mg/kg)进行睡眠实验，以大鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间为指标，评价造模成功与否。取模型制备成功的实验组大鼠50只，随机分为5组,分别为失眠模型组(M组)、地西泮组(D组)、熟眠胶囊高、中、低组(SM-H、SM-M、SM-L组)，每组10只。

2.2给药N组、M组大鼠灌胃生理盐水2 mL，1次/d；D组灌胃地西泮0.525 mg/kg，1次/d；SM-H、SM-M、SM-L组灌胃熟眠胶囊(28，14，7 g/kg)，给药剂量按动物与人体每千克体质量计量折算系数换算,系数为6.25[1]，1次/d,连续给药7 d。

2.3实时荧光定量PCR检测下丘脑、海马5-HT1a、5-HT2a受体mRNA的表达 于末次给药2 h后，各组动物在冰台上断头取下丘脑、海马组织，放入液氮中速冻，置于-80 ℃冰箱保存。所有试验器材都经灭活RNA酶处理。采用柱式Trizol总RNA提取试剂盒提取大鼠下丘脑、海马组织标本中的总RNA；TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix试剂盒将总RNA逆转录成cDNA后测定下丘脑、海马中的5-HT1a、5-HT2a受体mRNA的表达量。

以GAPDH作内参，采用2-ΔΔCt法分析大鼠下丘脑、海马5-HT1a、5-HT2a受体的基因相对表达量。2-ΔΔCt法相对定量分析结果判定：循环阈值(ΔCt)=Ct样品均值-Ct内参均值，ΔΔCt=ΔCt-(Ct阴性对照样品均值-Ct内参均值)。

实验荧光定量PCR检测引物为:GAPDH上游引物5’-acatgccgcctggagaaacct-3’，下游引物5’-gcccaggatgccctttagtgg-3’；5-HT1a上游引物5’-ccgcacgcttccgaatcc-3’，下游引物5’-tgtccg ttcaggctcttcttg-3’；5-HT2a上游引物5’-aacggtccatccacagag-3’，下游引物5’-aacaggaagaacacg atgc-3’。PCR扩增条件为:95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃20 s，72 ℃30 s，共40个循环。

3实验结果

3.1熟眠胶囊对失眠模型大鼠下丘脑、海马组织5-HT1amRNA表达量的影响给药结束后，各组大鼠下丘脑、海马组织5-HT1amRNA的相对表达量比较，差异有统计学意义。与M组比较,SM-H组下丘脑、海马组织5-HT1amRNA表达水平明显升高(P<0.01,P<0.01)；SM-M下丘脑、海马组织5-HT1amRNA表达水平升高(P<0.05，P<0.05)；SM-L组下丘脑、海马组织5-HT1amRNA表达水平的升高无统计学意义(P>0.05,P>0.05)；SM-H组与D组比较无统计学意义(P>0.05)。上述结果表明，熟眠胶囊可提高下丘脑、海马组织中的5-HT1amRNA的表达，与地西泮药效相近。结果见表1。

组 别下丘脑海马N组0.93±0.10 0.71±0.07 M组0.68±0.09 0.45±0.06 SM-H组0.82±0.08##△0.56±0.07##△SM-M组0.78±0.04# 0.53±0.07# SM-L组0.75±0.08 0.51±0.06 D组0.88±0.08## 0.63±0.06#

注：与M组相比#P<0.05；与M组比较##P<0.01；与D组比较△P>0.05

3.2熟眠胶囊对失眠模型大鼠下丘脑、海马组织5-HT2amRNA表达量的影响给药结束后，各组大鼠下丘脑、海马组织5-HT2amRNA的相对表达量存在统计学差异。与M组比较，SM-H组下丘脑、海马组织5-HT2amRNA表达水平明显降低(P<0.01，P<0.05)；SM-M下丘脑、海马组织5-HT2amRNA表达水平降低(P<0.05，P<0.05)；SM-L组下丘脑、海马组织5-HT2amRNA表达水平的降低无统计学意义(P>0.05，P>0.05)；SM-H组与D组比较无统计学意义(P>0.05)。上述结果表明，熟眠胶囊可降低下丘脑、海马组织中的5-HT1amRNA的表达，与地西泮药效相近。结果见表2。

组 别下丘脑海马N组0.69±0.09 0.35±0.12 M组0.90±0.07 0.71±0.10 SM-H组0.75±0.08##△0.54±0.11# SM-M组0.79±0.06# 0.56±0.10# SM-L组0.83±0.07 0.63±0.10 D组0.68±0.09## 0.41±0.11##

注：与模型组相比#P<0.05；与模型组比较##P<0.01；与安定组比较△P>0.05

4讨论

熟眠胶囊是王中男教授的多年临床验方，该方以归脾汤为基础，由人参、麦冬、当归、酸枣仁、五味子等中药组成，在临床上取得了良好的疗效。归脾汤治疗失眠在临床上多有报道，孙绍华等[2]应用加味归脾汤治疗失眠症50例，叶人等[3]应用归脾汤结合睡眠卫生宣教对心脾两虚型亚健康失眠患者进行干预,本科室[4]也报道了归脾熟眠汤治疗心脾两虚证失眠患者32例，均取得了良好的临床效果，但对其治疗失眠的作用机制尚未见研究报道。

5-HT能系统的功能涉及抑郁、损伤性应激、睡眠以及觉醒的调节等，其在触发和维持睡眠中起重要作用。5-HT合成抑制剂对氯苯丙氨酸(PCPA)可拮抗5-HT前体5HTP来引起失眠，腹腔注射PCPA引起的大鼠失眠是公认的动物失眠模型，肖成荣等[5]报道，PCPA连续给药2 d，第3天时大鼠下丘脑、海马组织中5-HT含量均降低；第7天大鼠的睡眠和自发活动都会迅速恢复到正常水平，而其脑中的5-HT含量仍低于正常水平的50%。

5-HT受体分为7个类型(5-HT1-7)，每个类型又分为多种亚型,在抗失眠研究最受到关注是5-HT1a和5-HT2a受体。研究表明5HT1a受体激动药具有减少快速动眼睡眠(REM)、增加REM潜伏期、升高脑内5HT含量的作用[6]。 研究表明[7]选择性5-HT2a受体拮抗剂可增加慢波睡眠(SWS)和非快速动眼睡眠(NREM)，减少觉醒次数且无对于REM的影响，因此认为5-HT2a受体拮抗药物是治疗失眠的比较理想药物。

熟眠胶囊可提高下丘脑及海马内5-HT1a受体mRNA含量，降低5-HT2a受体mRNA含量，提示熟眠胶囊可能是通过影响下丘脑及海马内5-HT1a、5-HT2a受体表达调节下丘脑及纹状体内5-HT能系统的作用，从而起到治疗失眠的作用。

参考文献：

[1]徐平.实验动物管理与使用操作技术规程[M].上海:上海科学技术出版社,2007:203-204.

[2]孙韶华,莫中周,李新平,等.加味归脾汤治疗失眠症50例[J].陕西中医,2005,26(2):129-130.

[3]叶人,袁拯忠,戴春秀,等.归脾汤结合睡眠卫生宣教对心脾两虚型亚健康失眠干预作用的临床研究[J].中国中药杂志,2011,36(16):2285-2288.

[4]张昊,吴九如,王中男.归脾熟眠汤治疗心脾两虚证失眠患者32例临床观察[J].中医杂志,2014,55(16):1390.

[5]肖成荣,马增春,李海静,等.PCPA失眠大鼠模型的制作及其机制[J].毒理学杂志,2007,21(4):326.

[6]Sue J WILSON,JAYNE E BAILEY,ANN S RICH,et al.The use of sleep measures to compare a new 5HT1aagonist with buspirone in humans [J].Nutt J Psychopharmacol,2005,19(6):609-613.

[7]FISH L R,GILLIGAN M T,HUMPHRIES A C,et al.4-Fluorosulfonylpiperidines:selective 5-HT2aligands for the treatment of insomnia [J].Bioorg Med Chem Lett ,2005,15(16):3665-3669.