布拉酵母菌与凝结芽孢杆菌混合固体发酵的培养基优化研究

■张 怡 刘敬为 童应凯

(天津农学院农学与资源环境学院生物技术实验室，天津 300384)

当今社会养殖业发展迅速，但同时抗生素的大量运用也存在诸多问题，抗生素使用时间过长容易使病原菌产生耐药性，抗生素会破坏肠道内微生态平衡，这时体外微生物就有可能入侵体内造成交叉感染[1]。而微生物制剂能够调节动物肠道平衡，并且能抑制很多致病菌，并且有助于动物肠道蠕动，促进消化，因此，动物微生物制剂自然在畜牧业中得到广泛的应用[2]。微生物制剂分为很多种，比如酵母菌、硝化细菌、芽孢杆菌、光合细菌、乳酸菌、EM菌等[3]，酵母菌做为非细菌性的益生菌的应用时间已久，在一定的程度上酵母菌能够对宿主健康有积极的影响[4]。布拉酵母菌作为微生态制剂的一种，可以预防抗生素造成的菌群失调[5]。布拉酵母菌对肠出血性大肠杆菌(EHEC)[6]与肠病原性大肠杆菌(EPEC)感染[7]有预防作用，并有可抑制烧伤患者患处细菌转运的作用[8]。凝结芽孢杆菌环境抗逆性强，能耐高温、抗干燥、抗胃酸，并且易于存储[9]。美国食品与药物管理局(FDA)和美国饲料控制官员协会将其列入可用于饲料的安全微生物菌种名单[10]。固体发酵作为一种发酵方法，过程容易控制、能耗低、操作简单、发酵产物高、对无菌要求相对较低、不易发生大面积污染[11]。本文通过将两种菌进行混合固体发酵，提高布拉酵母菌产量，进一步提高两种菌的益生效果。因此，本试验以测定生物量为目的，将布拉酵母菌和凝结芽孢杆菌进行混合固体培养优化，得到较优的培养条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

布拉酵母菌（Saccharomyces boulardii）、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)为天津农学院生物技术实验室保藏菌株。

1.1.2 培养基

① 肉汤培养基：牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、氯化钠0.5%，pH值为7.2～7.4，121℃ 灭菌20 min。

② 固体培养基底料：豆饼粉30%、麸皮30%、玉米粉40%，1∶1加水，121℃灭菌20 min。

③YEPD培养基：蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖2%，115℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 摇瓶液体菌种培养

将凝结芽孢杆菌接种于50 ml灭菌牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37 ℃恒温摇床中，转速为150 r/min，使其处于对数生长期(浓度为1×109～10×109CFU/ml)，培养18～24 h后，放入4℃冰箱中保存备用。

将布拉酵母菌接种于50 ml灭菌YEPD培养基中，置于恒温摇床中,转速为180 r/min，温度为30℃，培养18 h后，放入4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 添加化学试剂的布拉酵母菌与凝结芽孢杆菌混合固体发酵正交试验

为提高布拉酵母菌的生长数量，进行正交试验，选取L9(34)正交表(正交试验设计见表1)。在装有20 g固体培养基基料中，按正交试验表加入不同量营养物质，灭菌，待培养基灭菌完冷却后，加入2 ml的混合菌种子液（布拉酵母菌和凝结芽孢杆菌接种量都为5%），30℃培养48 h。

表1 布拉酵母菌与凝结芽孢杆菌混合固体发酵研究正交试验设计(%)

各试验组在30℃培养48 h后取出，每种样品取1 g稀释，用血球计数板法测量布拉酵母菌的数量。然后每种样品再取1 g，稀释到10-7涂布，37℃培养20～24 h，测量凝结芽孢杆菌数量。

1.2.3 最佳配方重复

布拉酵母菌和凝结芽孢杆菌的数量测定后，用极差分析出最佳结果，选出最佳培养基。然后重复最佳添加剂配方试验，再次进行培养。培养结束测量布拉酵母菌的数量和凝结芽孢杆菌的数量。

2 结果与分析

2.1 布拉酵母菌与凝结芽孢杆菌混合固体发酵正交试验结果（见表2）

表2 正交试验结果分析

由于本试验以布拉酵母菌高产为最终目标，所以观测指标是以布拉酵母菌数量为主。凝结芽孢杆菌只作为饲料中调节肠胃剂使用，所以对其数量要求不大。经过正交试验，布拉酵母菌和凝结芽孢杆菌的数量见表2所示，并用DPS软件进行极差分析，根据分析结果选出最佳配方。

由R值可知，影响正交试验结果的因素依次为A＞D＞B＞C，即影响发酵后布拉酵母菌产量的因素依次为葡萄糖、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁。

从K值也可以看出，在A3B1C2D3配方下，混合固体发酵培养基生长的布拉酵母菌数量最多，即以固体培养基（包括麸皮、豆饼粉、玉米粉）为底料，加入4%葡萄糖、无蛋白胨、0.005%硫酸镁、0.1%磷酸二氢钾，5%接种量，30℃培养48 h，布拉酵母菌与凝结芽孢杆菌混合固体发酵培养基能得到较高产量的布拉酵母菌。

2.2 正交试验相关性分析

根据2.1正交试验结果，对各因素做相关性分析，结果如表3所示。

表3 相关性分析

由表3所示，对于布拉酵母菌来说，葡萄糖、磷酸二氢钾和硫酸镁为正相关，蛋白胨为负相关。对于凝结芽孢杆菌来说，四个因素均为负相关。

结合两组相关性数据进行分析，发现两组数据中蛋白胨均为负相关。在发酵底物中含有丰富的氮源，豆饼粉、玉米粉都可以作为菌种的氮源，所以在发酵底物中不需要再过多添加氮源。说明在培养基添加剂优化中可以尝试少添加蛋白胨或者不再添加其它氮源，从而提高布拉酵母菌及凝结芽孢杆菌数量。

在表3中，葡萄糖、硫酸镁和磷酸二氢钾的添加对凝结芽孢杆菌数量均为负相关，对布拉酵母菌数量为正相关。说明这三个因素的添加只利于布拉酵母菌的生长，不利于凝结芽孢杆菌的生长，所以在实际生产中，可根据两菌种的需求量，平衡调整三个因素的添加量。由于本试验要求以布拉酵母菌数量为主要指标，所以在不过多影响凝结芽孢杆菌数量的前提下可以稍微提高三个因素添加量。

2.3 重复试验结果与分析

重复试验如下做两组：取10 g固体发酵培养基，1∶1加水，混合均匀，加入4%葡萄糖，不加蛋白胨，0.005%硫酸镁，0.1%磷酸二氢钾，灭菌。然后接入1 ml布拉酵母菌和1 ml凝结芽孢杆菌，30℃培养48 h。培养完成后按照先前的方法测量布拉酵母菌和凝结芽孢杆菌的含量。测量结果见表4。

表4 最佳配方重复试验

由表4可知，此次重复试验结果布拉酵母菌含菌量高于正交试验中数值，表示最佳配方确实提高了布拉酵母菌数量。而凝结芽孢杆菌没有高于正交试验中最大值，但也处于相对较多的水平上。结合2.2中相关性分析，重复试验结果刚好验证相关性分析结论。由于饲料中主要数据指标为布拉酵母菌数量，所以优化后配方在保证布拉酵母菌数量最大化的前提下，尽量加大了凝结芽孢杆菌数量，达到二者兼顾的目的，初步判断此配方成立。

3 讨论与结论

①在接种的时候一定要均匀的将菌种接入到固体培养基中。在固体培养基中菌体活动能力没有在液体培养基中强，接种不均匀可能导致菌体生长不统一，获得营养成分不一致等问题，会给试验结果带来影响。而且，固体发酵底料要妥善保存，避免染菌变质导致营养被消耗。

②通过对布拉酵母菌与凝结芽孢杆菌混合固体发酵正交试验分析及相关性分析，发现在固体发酵培养基中加入4%葡萄糖、不加蛋白胨、0.005%硫酸镁、0.1%磷酸二氢钾，各接入5%的布拉酵母菌和凝结芽孢杆菌，30℃培养48 h，布拉酵母菌与凝结芽孢杆菌混合固体发酵培养基能得到较高产量的布拉酵母菌。