姜黄素激活人膀胱癌T24细胞自噬诱导细胞凋亡

论著

姜黄素激活人膀胱癌T24细胞自噬诱导细胞凋亡

仇炜沈永青倪晓辰

项目来源：河北省中医药管理局科研计划项目(编号：2013005)

作者单位： 050020河北省石家庄市鹿泉区人民医院外科(仇炜，现就读于首都医科大学附属北京友谊医院泌尿外科)；河北中医学院护理学院(沈永青)；河北医科大学第四医院泌尿外科(倪晓辰)

E-mail:nixiaochenhb@163.com

【摘要】目的探讨姜黄素(Cur)对人膀胱癌T24细胞株的抗肿瘤作用及其对细胞自噬的影响。方法采用CCK-8法检测Cur对T24细胞增殖的抑制作用；Annexin V/PI法检测细胞凋亡情况；采用Western blot对细胞LC3B及P62蛋白表达量进行检测；吖啶橙染色观察细胞内自噬囊泡的改变。结果Cur可以显著抑制T24细胞增殖，诱导细胞凋亡(P<0.01)。Cur诱导T24细胞发生自噬，显著上调LC3蛋白表达，下调P62蛋白表达，增加细胞内自噬囊泡的数量(P< 0.01)。Cur增强顺铂(cis-Dichlorodiamineplatinum，CDDP)的促凋亡作用(P<0.01)。结论Cur可显著抑制膀胱癌T24细胞的增殖并通过激活细胞自噬促进肿瘤细胞凋亡，Cur可增强CDDP的抗肿瘤效果。

【关键词】姜黄素；膀胱癌；凋亡；增殖；自噬

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.20.004

通讯作者：倪晓辰，050011河北医科大学第四医院泌尿外科；

【中图分类号】R 737.14

收稿日期：(2015-04-27)

The anti-tumor effects of curcumin on human bladder cancer cell line (T24) and its effects on cell autophagy in vitroQIUWei*,SHENYongqing,NIXiaochen.*DepartmentofSurgery,People’sHospitalofLuquanDistrict,Hebei,Shijiazhuang050200,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the anti-tumor effects of curcumin on human bladder cancer cell line (T24) and its effects on cell autophagy in vitro.MethodsThe inhibition effects of curcumin on cell proliferation of T24 cell line were detected by CCK-8 assay. The cell apoptosis rate was determined by Annexin V/PI assay. The expression levels of LC3B and P62 protein were detected by Western Blot. The changes of autophagic vacuoles were observed by acridine orange staining.ResultsCurcumin could obviously inhibit the proliferation of T24 cells and induce cell apoptosis (P<0.01). Curcumin induced autophagy of T24 cells, up-regulated expression levels of LC3 protein, down-regulated expression levels of P62 protein and increased the numbers of autophagic vacuoles (P<0.01). Moreover curcumin enhanced the apoptosis effect of cis-Dichlorodiamineplatinum (CDDP,P<0.01).ConclusionCurcumin can obviously inhibit the proliferation of T24 cells and induce cell apoptosis through cell autophagy, moreover, curcumin can enhance the anti-tumor effects of CDDP.

【Key words】curcumin; bladder cancer; apoptosis; proliferation; autophagy

膀胱癌是我国发病率最高的泌尿系统恶性肿瘤，且随着我国人口老龄化的加剧、环境因素等方面的原因，膀胱癌的发病率仍呈现不断增高的趋势。目前，早期膀胱癌的治疗仍以手术为主，及时进行彻底的手术治疗往往能够收到较为理想的治疗效果。然而晚期膀胱癌以及复发性膀胱癌的治疗却十分困难，目前临床多给予全身化疗。由于化疗药物的副作用较多，在治疗期间患者经常会遭受巨大痛苦，更为严重的是尽管我们现在有很多种化疗药物和方案，但是仍旧无法解决肿瘤耐药的问题，一旦肿瘤细胞发生耐药将会导致整个化学治疗的失败。所以找到一种既能够减少化疗药物用量，又能够提高化疗效果的办法就显得尤为紧迫。姜黄(curcuma longa)作为中药，在我国具有悠久的应用历史。姜黄素(Curcumin, Cur)是从姜黄的根茎中提取的一种天然化合物[1]，现代研究表明该化合物具有多种生物学活性[2,3]，同时由于其良好的抗肿瘤效果，Cur在肿瘤研究领域也愈发受到关注。已有研究报道，Cur具有抗肝癌[4]、直肠癌[5]等多种肿瘤的作用，此外Cur还能够增加某些传统化疗药物的化疗效果，如5-氟尿嘧啶、吉西他滨[6-8]等。本研究拟针对Cur对膀胱癌的抗肿瘤效果及其机制进行进一步的探索，为Cur的临床应用提供实验室依据。

1材料与方法

1.1实验材料人膀胱癌细胞系T24购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心；RPMI 1640培养基及胎牛血清购自Hyclone公司；姜黄素、顺铂(cis-Dichlorodiamineplatinum，CDDP)、LC3B抗体、吖啶橙(Acridine orange, AO)及3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine, 3-MA)来自美国Sigma-Aldrich公司；CCK-8及细胞裂解液为南京凯基生物科技发展有限公司产品；BCA法蛋白定量试剂盒为美国Thermo Fisher公司产品；P62及GAPDH抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养:使用胎牛血清终浓度为10%的RPMI1640培养基培养T24细胞，培养条件为37℃，5% CO2，每2～3天更换培养液，1∶3 传代。

1.2.2CCK-8细胞增殖试验:将处于对数生长期的T24细胞接种至96孔透明细胞培养板内，细胞贴壁后加入Cur处理，之后每孔加入CCK-8试剂10 μl，将细胞重新置于细胞培养箱内继续孵育3 h，使用酶标仪比色，比色波长为450 nm。

1.2.3Annexin V/PI细胞凋亡检测:待检测细胞消化后，1 000 r/min 5 min离心收集，使用PBS洗涤细胞两次，缓慢加入结合缓冲液500 μl，轻微震荡使细胞重悬，分别加入Annexin V和PI各5 μl，震荡混匀后避光室温孵育15 min，流式细胞仪检测。

1.2.4Western blot:使用细胞裂解液将待测细胞裂解后，BCA法蛋白定量试剂盒定量，加入上样缓冲液混匀后加热变性，取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，恒流300 mA 60 min转膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗4℃孵育过夜，次日二抗室温孵育1 h，ECL化学发光，拍照存档，本文所使用一抗工作浓度均为1∶1 000。

1.2.5吖啶橙染色试验：使用PBS缓冲液将OA稀释至终浓度1 μg/ml，将稀释好的OA缓慢滴加入待测细胞，避光室温染色2 min，将OA吸出，并使用PBS缓冲液洗涤两次。倒置荧光显微镜观察并拍照。每组最少随机计数300个细胞。

2结果

2.1Cur对人膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响分别给予不同浓度(5、10、20 μmol/L)的Cur处理膀胱癌T24细胞24 h，DMSO组细胞增殖未受到明显影响，但是Cur给药组细胞增殖均出现了不同程度的下降，Cur浓度为5、10、20 μmol/L时，细胞抑制率分别为3.63%、40.23%、85.73%，其中Cur浓度为10 μmol/L 时，细胞增殖活性受到显著抑制，差异有统计学意义(P<0.01)。使用终浓度为10 μmol/L的Cur孵育T24细胞不同时间(12、24、48 h)再进行CCK-8试验，结果表明，随着给药时间的延长，T24细胞的增殖活性也受到了不同程度的下降，细胞增殖活性较对照组分别下降了6.47%、44.42%、87.52%，差异有统计学意义(P<0.01)。把10 μmol/L Cur处理了不同时间(24 h、48 h)的T24细胞进行Annexin V/PI染色，然后使用流式细胞术检测，Cur给药组的细胞凋亡率明显上升，0 h、24 h和48 h的细胞凋亡率分别为(4.08±0.79)%、(12.30±1.22)%和(29.86±1.27)%，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1～3，图1～3。

2.2Cur对于T24细胞自噬的影响使用Westernblot检测T24细胞LC3和P62蛋白的表达量，结果表明在Cur(10 μmol/L)作用细胞后12 h及24 h，细胞的LC3表达量明显上升，P62蛋白的表达量明显下降。使用OA进行染色后进行荧光显微镜观察，在Cur处理组细胞中，自噬囊泡的数量较对照组明显增多，含有自噬囊泡的细胞数量明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。上述结果说明，Cur能够诱导T24细胞发生自噬，且该作用早于凋亡的发生。见表4，图4～6。

图1Cur对(24 h)作用T24后细胞增殖活力随剂量增加下降

图2Cur(10 μmol/L)作用T24后细胞增殖活力随时间延长下降

图3Cur(10 μmol/L)作用T24后细胞凋亡率上升

图4Cur(10 μmol/L)作用T24后细胞后LC3和P62蛋白表达情况

图5Cur(10 μmol/L，6 h)作用T24细胞后胞质后胞质内自噬囊泡增多(400×)

图6细胞内自噬囊泡计数

表1　Cur(24 h)作用T24后细胞增殖活力随剂量增加变化情况　 ±s

注：与0 μmol/L、DMSO、5 μmol/L比较，*P<0.05

表2Cur(24 h)作用T24后细胞增殖活力随时间变化情况

0hDMSO12h24h48h细胞活力1.000±0.0751.005±0.0200.935±0.012*0.556±0.013*0.125±0.010*

注：与0 h、DMSD比较，*P<0.05

表3Cur(24 h)作用T24后细胞凋亡率变化

0h24h48h凋亡率4.083±0.78812.303±1.221*29.857±1.010*

注：与0 h比较，*P<0.01

表4　细胞内自噬囊泡计数　%, ±s

注：与Ctrl比较，*P<0.01

2.3Cur诱导的细胞自噬与凋亡之间的关系使用自噬抑制剂3-MA (2 mmol/L)进行试验，结果表明3-MA+Cur处理组细胞的凋亡率为(8.44±0.93)%， Cur单独处理组的凋亡率为(12.30±1.22)%，3-MA+Cur处理组较Cur单独处理组凋亡率显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。上述结果说明，Cur诱导的细胞自噬与其凋亡诱导效应有关。见表5，图7。

2.4Cur对CDDP抗肿瘤作用的影响Annexin V/PI检测结果表明，Cur和CDDP单独应用均可以促进T24细胞发生凋亡，当Cur与CDDP联合应用时，诱导肿瘤细胞凋亡的作用更加明显。对照组细胞凋亡率为(4.03±0.76)%，Cur处理组和CDDP处理组的凋亡率

图7　Cur (10 μmol/L, 24 h)通过诱导细胞自噬促进细胞凋亡

Cur-+++3-MA-+-+凋亡率3.887±0.7653.713±1.397*13.813±1.896*8.440±0.931#

注：与Cur-、3-MA-比较，*P<0.01；与Cur-、3-MA+比较，#P<0.01

分别为(13.88±2.62)%、(28.11±2.04)%，而Cur+CDDP组的凋亡率则明显上升，为(47.21±2.08)%。见表6，图8。

表6　Cur(10 μmol/L，24 h)增强CDDP(30 μmol/L，24 h)

注：与CDDP比较，*P<0.01

3讨论

膀胱癌是我国最常见的泌尿系统恶性肿瘤，该病的治疗现在主要分为手术、化疗、放疗三类，早期膀胱癌的治疗多以手术治疗为主，晚期膀胱癌及复发性膀

图8Cur (10 μmol/L,24 h)增强CDDP (30 μg/ml, 24 h)的凋亡诱导效果

胱癌的治疗则多以全身化疗为主。目前我国膀胱癌全身化疗应用最多的是吉西他滨联合顺铂的化疗方案(GC方案)，然而化疗不仅副作用多，也存在着化疗抵抗、化疗不敏感、化疗耐药等种种问题。

自噬在细胞正常的生理过程中起着非常重要的作用，自噬能够维持细胞内环境的稳态，同时自噬也是细胞生理代谢的一个重要组成部分。自噬与人类多种疾病有关，而自噬与肿瘤的关系仍不是十分清楚[9]。有假说指出，正常生理情况下，自噬能够清除可以损伤DNA的物质，如错误折叠的蛋白质、ROS等，从而维持基因组的完整性和稳定性，具有抑制肿瘤发生的作用。而当肿瘤形成后，自噬可以提供给肿瘤细胞更多的能量，给予其更强的生存优势，具有促进肿瘤细胞生长的作用。本研究发现Cur具有显著地抗膀胱癌作用，能够显著抑制膀胱癌细胞的增殖，促进细胞凋亡。同时我们的研究结果发现Cur能够激活膀胱癌细胞自噬。LC3蛋白是细胞自噬的标志蛋白，在自噬过程中，LC3-Ⅰ酯化形成 LC3-Ⅱ型蛋白并定位于自噬泡上，本研究结果发现Cur能够显著促进LC3-Ⅱ的形成，LC3-Ⅱ的表达量明显上升(图2A)。P62蛋白是自噬的特异性底物，在给予了Cur处理后，T24细胞的P62表达量明显下调(图2A)。使用OA染色细胞进行形态学观察，也表明Cur处理后的细胞自噬囊泡的数量明显增加。以上结果均说明Cur可以诱导肿瘤细胞自噬。我们又进一步使用了自噬的抑制剂3-MA进行研究，发现当给予3-MA抑制T24细胞自噬活动后，能够部分的逆转Cur对肿瘤细胞的杀伤作用(图3)，表明T24的凋亡诱导作用是通过激活自噬发挥作用的。已有研究表明某些天然化合物具有激活自噬，诱导肿瘤细胞凋亡的作用[10]，我们的结果表明Cur可能也具有相类似的作用机制。更有意义的是，我们使用了膀胱癌治疗常用的化疗药物CDDP进行试验，发现Cur能够增强CDDP的药效，推测该作用可能与Cur的自噬激活作用有关。

本研究从体外水平验证了Cur的抗膀胱癌作用，并初步阐明了其作用机制，表明Cur的细胞凋亡诱导效应与自噬激活有关，联合应用Cur能够增强CDDP的药效，从而丰富了Cur的抗肿瘤谱，拓宽了Cur的应用，为Cur的临床使用提供了实验依据。

参考文献

1Shanmugam MK, Rane G, Kanchi MM, et al. The multifaceted role of curcumin in cancer prevention and treatment. Molecules,2015,20:2728-2769.

2Chan MM, Adapala NS, Fong D. Curcumin overcomes the inhibitory effect of nitric oxide on Leishmania. Parasitol Res, 2005, 96: 49-56.

3Sreejayan, Rao MN. Nitric oxide scavenging by curcuminoids. J Pharm Pharmacol, 1997, 49: 105-107.

4Marquardt JU, Gomez-Quiroz L, Arreguin Camacho LO, et al. Curcumin effectively inhibits oncogenic NF-kB signaling and restrains stemness features in liver cancer. J Hepatol, 2015,32:197-201.

5Shakibaei M, Kraehe P, Popper B, et al. Curcumin potentiates antitumor activity of 5-fluorouracil in a 3D alginate tumor microenvironment of colorectal cancer. BMC Cancer, 2015, 15: 250.

6Shakibaei M, Mobasheri A, Lueders C, et al. Curcumin enhances the effect of chemotherapy against colorectal cancer cells by inhibition of NF-kappaB and Src protein kinase signaling pathways. PLoS One,2013,8:e57218.

7Kunnumakkara AB, Guha S, Krishnan S, et al. Curcumin potentiates antitumor activity of gemcitabine in an orthotopic model of pancreatic cancer through suppression of proliferation, angiogenesis, and inhibition of nuclear factor-kappaB-regulated gene products. Cancer Res, 2007, 67: 3853-3861.

8Shakibaei M, Buhrmann C, Kraehe P, et al. Curcumin chemosensitizes 5-fluorouracil resistant MMR-deficient human colon cancer cells in high density cultures. PLoS One, 2014, 9:85397.

9Choi AM, Ryter SW, Levine B. Autophagy in human health and disease. N Engl J Med, 2013, 368: 1845-1846.

10倪晓辰, 赵志红, 马永良, 等. 桧木醇诱导人肾透明细胞癌786-O细胞凋亡及其机制研究. 中国肿瘤临床, 2015, 42: 43-46.