慢病毒介导稳定表达miR-183的人卵巢癌skov3细胞系

陈亚伟，樊冬梅，刘　刚，田晓予



慢病毒介导稳定表达miR-183的人卵巢癌skov3细胞系

陈亚伟，樊冬梅，刘刚，田晓予

摘要：目的建立稳定表达miR-183的人卵巢癌skov3 细胞系。方法将Pre-miR-183、has-miR-183 inhibitor基因克隆到真核表达载体pEZX-MR03、pEZX-AM03中，构建成重组表达载体pEZX-MR03-183 mimics、pEZX-AM03-183 inhibitor，再将重组表达载体转染至293T细胞中包装慢病毒。用包装好的慢病毒感染人卵巢癌skov3 细胞，经嘌呤霉素、潮霉素B筛选后获得稳转细胞系，最后用RT-PCR法检测miR-183在转录水平的表达。结果分离培养出稳定高表达和低表达 mirR-183的单克隆细胞株。结论实验成功建立了稳定表达miR-183的 skov3细胞系，为研究miR-183的生物学功能提供了有效的细胞模型。

关键词：慢病毒；skov3细胞； miR-183；卵巢瘤

作者单位：河南科技大学第一附属医院，河南洛阳 471003

卵巢癌是女性生殖道常见的恶性肿瘤之一，由于其发病十分隐匿，大多数患者在确诊时已经处于晚期，失去手术机会。虽然化疗在卵巢癌的治疗中占重要地位，但耐药的产生也使卵巢癌化疗难以取得理想效果[1-3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类调节性小RNA，长约18～22个核苷酸，它本身不编码蛋白，但对蛋白编码基因有重要的调控作用。miRNAs与多种肿瘤密切相关，它可调控肿瘤相关基因的表达，参与肿瘤细胞的生长发育、凋亡、增殖、血管形成、侵袭迁移等一系列重要进程，在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用[5-7]。其中，miR-183在卵巢癌中存在异常表达，但它是促癌 miRNA 还是抑癌 miRNA，报道并非一致[8-9]。用miRNA芯片和实时RT-PCR技术检测发现，与相对低侵袭力的skov3细胞相比较，miR-183在高侵袭力的SKOV3ip细胞中呈低表达[10]。而miR-22，miR-183和miR-31通过抑制Tiam1的蛋白表达，进而抑制细胞迁移、侵袭和生长，但不影响细胞凋亡。为研究miR-183在卵巢癌中的作用，作者采用慢病毒转染试剂将Pre-miR-183、has-miR-183 inhibitor基因导入人卵巢癌skov3细胞中，并经嘌呤霉素、潮霉素B筛选，建立稳定表达mirR-183的细胞株，为今后研究miR-183的生物学功能提供有效的细胞模型。

1材料与方法

1.1材料人卵巢癌skov3细胞株购自中国科学院上海细胞库，293T细胞由河南科技大学第一附属医院分子生物实验室传承。MiR-183的真核表达载体pEZX-MR03-183 mimics、pEZX-AM03-183 inhibitor及阴性对照(negative control,NC)均由广州复能基因有限公司构建。RPMI-1640培养基、DMEM高糖培养基(美国Gibco)，Opti-MEM®I (美国Invitrogen)、胎牛血清(以色列BI)，miRNA提取分离试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，Lenti-Pac HIV表达包装试剂盒、miR-183 和 miR-U6 qPCR检测引物、miRNA反转录及其qPCR试剂盒(广州复能基因有限公司)，嘌呤霉素(美国 Life)，潮霉素B(美国Invitrogen)。

1.2方法

1.2.1确定嘌呤霉素、潮霉素B筛选浓度筛选前1 d，将skov3细胞以每孔5×104个接种到24孔板中，加入0.5 mL含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基，37 ℃、5%CO2条件下培养，至细胞融合度达到60%～70%。嘌呤霉素(0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mg·L-1)、潮霉素B(100、110、120、130、140、150 mg·L-1)按不同浓度梯度分别加入到铺好的24孔板中，每天换液，浓度不变，培养3 d使skov3细胞全部死亡的最小浓度即为筛选浓度。

1.2.2包装慢病毒转染前1 d，取对数生长期的293T细胞2×106个接种于10 cm细胞培养皿中，加入10 mL含10% 胎牛血清的DMEM高糖培养基，37 ℃、5%CO2条件下培养，至细胞融合度达到50%～60%。分别将2.5 μg的pEZX-MR03-183 mimics、pEZX-AM03-183 inhibitor及NC和5.0 μL的Lenti-Pac HIV加入到200 μL的Opti-MEM®I培养基中。 此外，另取200 μL的Opti-MEM®I培养基并加入15 μL的EndoFectin Lenti。最后，将后者倒入前者，混匀，室温静置20 min后，加到293T细胞中，培养48 h，收集细胞上清液， 经过离心(4 ℃，3 000 r·min-1，15 min)和过滤(0.45 μm)收集病毒液。

1.2.3细胞转染转染前12 h，将skov3细胞以每孔5×105个接种到6孔板中，加入2 mL含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基，37 ℃、5%CO2条件下培养，至细胞融合度达到50%～60%；弃掉旧培养基，加入2 mL新鲜培养基，然后分别加入4种慢病毒液，24 h后换培养基并继续培养。

1.2.4稳转细胞株筛选观察转染后的skov3细胞荧光情况，并根据载体所携带抗性基因的不同，于转染后72 h分别加入相对应的抗生素，嘌呤霉素(1 mg·L-1)，潮霉素B(120 mg·L-1)进行筛选(嘌呤霉素持续加入，潮霉素B加24 h撤24 h，反复3次)，根据细胞死亡情况及时更换培养基。常规传代，待细胞状态转好后，药物浓度加大1倍进一步筛选，待细胞筛纯后，药物浓度减半维持。

1.2.5RT-PCR检测miR-183在skov3细胞中的表达 细胞转染筛纯后，用miRNA提取分离试剂盒提取miR-183，并检测RNA质量及浓度。按照All-in-One TM miRNA qRT-PCR Detection Kit 说明书将miR-183反转录成cDNA，并扩增，均以U6为内参。PCR反应条件为：95 ℃ 10 min预变性，95 ℃ 10 s变性，60 ℃ 20 s退火，72 ℃ 30 s延伸，共40个循环。

2结果

2.1嘌呤霉素、潮霉素B筛选浓度嘌呤霉素、潮霉素B筛选正常skov3细胞3 d后，嘌呤霉素浓度≥1 mg·L-1，潮霉素B浓度≥120 mg·L-1时，skov3细胞全部死亡。嘌呤霉素，潮霉素B的最佳筛选浓度分别为1 mg·L-1、120 mg·L-1。大约筛选10～14 d可获得稳转细胞株。

2.2包装病毒、细胞转染及筛选293T细胞24 h即出现荧光，48 h荧光最强。由图1可见稳转的skov3细胞株。其中，pEZX-MR03-183 mimics及NC携带eGFP标签发出绿色荧光，pEZX-AM03-183 inhibitor及NC携带RFP标签发出红色荧光，并且细胞形态均无明显变化。

2.3skov3细胞中miR-183的相对表达量RT-PCR检测miR-183在各组稳转skov3细胞株中的表达，包括4组分别为miR-183 mimics 及NC，miR-183 mimics及NC。采用经典的2-ΔΔCt相对定量计算方法来计算各组间的表达差异，与NC组相比较，inhibitor组下调 0.19倍，而mimics组上调13.54倍。

A、B为上调NC；C、D为miR-183 mimics；

3讨论

异常表达的miRNA可能在卵巢癌的发生发展、侵袭转移以及耐药等过程中起重要作用。研究发现与卵巢癌细胞相关的miRNA包括：miR-7f、miR-10b、miR-21、miR-34、miR-145、miR-152、miR-181、miR-199a、miR-29a、miR-126、miR-101、miR-200c、miR-100、miR-182、miR-16、miR-15a、miR-20a、miR-205、miR-214等[12-20]在卵巢癌中表达异常。其中，miR-183在卵巢癌也是异常表达的[8-11]，但其究竟扮演癌基因还是抑癌基因的角色仍存在争议。Dahiya等研究表明miR-183在卵巢癌组织中下调0.45倍。与正常卵巢组织相比hsa-miR-183-5p在卵巢癌组织中上调，提示miR-183可能参与卵巢癌的发展。与相对低侵袭力的skov3细胞相比较，miR-183在高侵袭力的SKOV3ip细胞中呈低表达[10]。通过建立稳定表达miR-183的卵巢癌细胞系，来进一步研究miR-183对卵巢癌细胞生物学行为的影响更是少见报道。

本实验首先构建真核表达载体pEZX-MR03-183 mimics、pEZX-AM03-183 inhibitor及相应NC，通过慢病毒介导的方法将其转染至skov3细胞中，再用嘌呤霉素、潮霉素B对转染后细胞进行筛选，最终获得稳定表达miR-183的skov3细胞系。其中，细胞转染及筛选过程至关重要，由于转染前细胞的状态好坏对最终的转染效果影响很大，所以应保证加病毒之前细胞处于良好的生长状态。而慢病毒液对细胞有毒性作用，刚转染过的细胞状态不好，筛选时间及药物浓度不易掌握，可常规培养细胞至其状态好转后再筛选。并且，在筛选过程中要及时观察细胞状态，以免筛选过度损伤转染成功的细胞导致实验失败。本研究通过RT-PCR检测各组稳转细胞株中miR-183的表达情况，成功建立miR-183慢病毒介导的skov3稳转细胞系，为以后进一步研究miR-183与卵巢癌skov3细胞生物学特性(增殖、凋亡、侵袭、耐药、裸鼠成瘤等)的相关性提供细胞学模型，为研究miR-183与卵巢癌的关系奠定基础。

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Establishment of Human Ovarian Cancer Skov3 Cell Line Stably

Expressing miR-183 by Lentiviral System

CHEN Ya-wei,FAN Dong-mei,LIU Gang,et al

(First Affiliated Hospital，Henan University of Science & Technology，Luoyang 471003，China)

Abstract:ObjectiveTo establish human ovarian cancer skov3 cell line stably expressing miR-183. MethodsThe gene of Pre-miR-183,has-miR-183 inhibitor were cloned into eukaryotic expression vector,respectively,yielding pEZX-MR03-183 mimics, pEZX-AM03-183 inhibitor. The pEZX-MR03-183 mimics,pEZX-AM03-183 inhibitor were transfected into 293T cells for acking lentivirus, and the lentivirus transfected in human ovarian cancer skov3 cells. Screening with puromycin and hygromycin B, there got the stable transfection skov3 cell line, and through RT-PCR to verify the expression of miR-183 at transcription level. ResultsThe monoclonal skov3 cell line with stable high and low expression of miR-183 were successfully isolated and cultured.ConclusionThe study successfully establish the stably transfected skov3 cell lines of miR-183 that could be used to be an effective cell model to research the biological functions of miR-183.

Key words:lentivirus；skov3 cell；miR-183；ovarian cancer

通信作者：田晓予，女，博士，教授，E-mai：tiaoxiaoy1210@163.com

作者简介：陈亚伟(1988-)，女，河南开封人，从事妇科肿瘤的基础与临床研究工作。

收稿日期：2015-07-09

中图分类号：R737.31

文献标志码：A

文章编号：1672-688X(2015)04-0248-04