雷帕霉素及环孢素对人类外周血CD4+CD2+5调节性T细胞体外增殖的影响

赵冰清，朱志军，王永磊(天津市第二人民医院，天津009;首都医科大学附属北京友谊医院;天津医院)

雷帕霉素及环孢素对人类外周血CD4+CD2+5调节性T细胞体外增殖的影响

赵冰清1，朱志军2，王永磊3
(1天津市第二人民医院，天津300192;2首都医科大学附属北京友谊医院;3天津医院)

摘要:目的观察雷帕霉素与环孢素对人类外周血CD4+CD2+5调节性T细胞(Treg)体外增殖的影响。方法利用免疫磁珠法提取健康成人外周血CD4+CD2+5Treg，流式细胞仪检测CD4+CD2+5Treg纯度;将羧基荧光素乙酰乙酸进行标记的CD4+CD2+5Treg分为A、B、C组，分别加入100 nmol/L雷帕霉素、410 nmol/L环孢素及空白培养基;培养7d后上流式细胞仪，计算原代细胞所占比例。结果A组原代细胞所占比例为8.8%±3.2%，B组为48.9%± 7.0%，C组为33.2%±4.3%; A、B组分别与C组比较，P均＜0.05。结论雷帕霉素可促进CD4+CD2+5Treg的体外增殖，有利于移植后患者免疫耐受的形成;而环孢素则抑制CD4+CD2+5Treg的体外增殖，不利于免疫耐受的形成。

关键词:调节性T细胞;雷帕霉素;环孢素;免疫耐受;细胞培养

Effect of rapamycin and ciclosporin on proliferation of human periheral blood CD4+CD2+5regulatory T cells

ZHAO Bing-qing1，ZHU Zhi-jun，WANG Yong-lei
(1 Tianjin Second People's Hospital，Tianjin 300192，China)

Abstract:Objective To observe the influence of rapamycin and ciclosporin on the proliferation of human periheral blood CD4+CD2+5regulatory T cells.Methods The CD4+CD2+5regulatory T cells(Treg cells)from human peripheral blood were isolated by immunomagnetic bead separation，the purity of CD4+CD2+5Treg wasmeasured by flow cytometry.Wedivided the CD4+CD2+5Treg into the groups A，B and C，which were added with 100 nmol/L rapamycin，410 nmol/L cyclosporine and the blank culturemedium.After 7days'culture，we calculated the percentage of primary Treg cells ofdifferent groups by flow cytometry.Results The percentage of primary Treg cells in the groups A，B and C were 8.8%±3.2%，48.9%±7.0% and 33.2%±4.3%，respectively.Significantdifference was found when we compared groups A and B with group C，respectively(all P＜0.05).ConclusionRapamycin can significantly promote the proliferation of CD4+CD2+5Treg in vitro，and it promotes the formation of immune tolerance in patients after transplantation; but cyclosporine inhibits the proliferation of CD4+CD2+5Treg and hampers the progression.

Key words:regulatory T cells; rapamycin; ciclosporin; immune tolerance;cell culture

雷帕霉素和环孢素是器官移植患者常用的免疫抑制类药物，具有减少免疫细胞的增殖和活化、抑制移植排斥反应、延长移植物存活时间的作用。CD4+CD2+5调节性T细胞(Treg)可诱导患者免疫耐受形成，从而减少甚至避免免疫抑制剂的应用。2012 年3月～2013年1月，我们观察了雷帕霉素和环孢素对CD4+CD2+5Treg体外活化增殖的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料以天津市第一中心医院移植外科工作人员9人作为志愿者，每人采集外周血50～100mL。人类CD4+CD2+5Treg分选试剂盒、磁式细胞分选器、LD分选柱、MS分选柱及CD4+CD2+5Treg增殖试剂盒购于德国美天旎生物技术有限公司; APCCD25抗体、FITC-CD4抗体及PE-Foxp3抗体购于美国eBioscience公司;雷帕霉素购于美国惠氏制药公司;环孢素购于瑞士诺华制药有限公司; FACSCalibur流式细胞仪购于美国BD公司。

1.2CD4+CD2+5Treg细胞的提取及功能验证取外周血样本，采用免疫磁珠法提取CD4+CD2+5Treg，按

试剂盒说明书操作。利用流式细胞仪检测CD4+CD2+5Treg纯度，纯度均达到97.0%±0.8%，细胞内Foxp3表达率均达到99%以上。

1.3细胞增殖情况观察将CD4+CD2+5Treg用羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)染色标记，然后平均分成A、B、C组进行培养，每组至少设3个复孔。培养过程中，在加入必需培养基(含抗CD3/CD28单抗所包被的磁珠及高浓度重组人IL-2的RPMI-1640完全培养基)的基础上，A组添加雷帕霉素100 nmol/L，B组添加环孢素410 nmol/L，C组不添加任何其他试剂。各组细胞于相同环境下(37.5℃、饱和湿度、5% CO2培养箱)培养，定期更换培养基并添加相应试剂;培养7d后上流式细胞仪检测，计算原代细胞所占比例，根据原代细胞所占比例判断CD4+CD2+5Treg增殖活性，原代细胞所占比例越少，说明CD4+CD2+5Treg增殖活性越高。

1.4统计学方法采用SPSS13.0统计软件，结果以x珋±s表示，组间比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

培养7d后，流式细胞仪检测各组细胞增殖情况见图1。如图所示，原代细胞CFSE荧光强度最高(A组中M2，B组中M2，C组中M3)，而传代细胞荧光强度则呈对半递减趋势。经统计，A组原代细胞所占比例为8.8%±3.2%，B组为48.9%±7.0%，C组为33.2%±4.3%; A、B组与C组比较，P均＜0.05。

图1　各组CD图4+CD图2+图5Treg细胞增殖情况

3　讨论

研究表明，雷帕霉素在细胞内与FK506结合蛋白12(FKBP12)结合形成雷帕霉素-FK-BP12复合物，后者作用于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，抑制mTOR信号通路的作用，从而阻断IL-2受体或生长因子受体激活的下游通路，阻断T淋巴细胞从G1期到S期的进程，使T淋巴细胞的活化停滞在G1期，进而抑制T细胞增殖发挥免疫抑制作用［1］。另外，雷帕霉素还能够抑制在细胞周期中有关键作用的原癌基因Bcl-2的转录，减少Bcl-2的表达，促使活化的淋巴细胞凋亡。体外实验证实，雷帕霉素能促进小鼠CD4+CD2+5Treg增殖［2～4］，增殖后产生的细胞同样能够抑制同源的效应性T淋巴细胞。Blaha等［5］研究表明，雷帕霉素并不阻碍移植耐受，而钙调蛋白抑制剂却阻碍移植耐受。

本研究显示，雷帕霉素对体外培养的CD4+CD2+5Treg增殖有明显促进作用。雷帕霉素与环孢素或他克莫司等联合应用时均有良好的协同作用，考虑其可能是通过CD4+CD2+5Treg这一途径间接增强免疫抑制效果。目前，有关雷帕霉素与CD4+CD2+5Treg之间相互影响的研究很多，但多集中在检测用药前后人体内CD4+CD2+5Treg比例的变化、相关细胞因子的变化等。相关实验显示，雷帕霉素促进CD4+CD2+5Treg增殖的效应与TGF-β和IL-10等细胞因子关系密切。TGF-β和IL-10是CD4+CD2+5Treg分泌的主要免疫抑制性因子［6］。大鼠应用雷帕霉素喂养后，外周血中TGF-β、IL-10、Foxp3mRNA含量明显高于对照组，表明雷帕霉素可一定程度上诱导CD4+CD2+5Treg增殖，提示雷帕霉素实现免疫抑制作用可能与CD4+CD2+5Treg分泌的细胞因子有密切关系［7］。Bocian等［8］研究发现，雷帕霉素组中外周血中TGF-β1含量明显较环孢素组及空白对照组多。结合TGF-β1在CD4+CD2+5Treg增殖及功能维持方面的重要作用，推测雷帕霉素可能通过某种机制促进TGF-β1表达，进而有利于CD4+CD2+5Treg扩增。Yamazaki等［9］证实，雷帕霉素可诱导CD4+CD2+5T淋巴细胞转化为CD4+CD2+5Treg进而发挥免疫抑制作用。

环孢素属于钙调磷酸酶抑制剂(CaN)，其与嗜环蛋白形成复合物，抑制钙调磷酸酶的活化，阻碍活化T细胞核因子(NFAT)的去磷酸化与核转位，从而阻断IL-2转录和T细胞活化，发挥免疫抑制作用［10］，用于心、肝、肾、肺、胰腺、骨髓等器官的移植均获得满意效果。IL-2是T细胞增殖的主要生长因子，同时对CD4+CD2+5Treg的产生、功能维持等起重要作用。而雷帕霉素虽能抑制T细胞mTOR通路，但对IL-2未见影响。Kim等［11］提出，CaN及IL-2受体单克隆抗体减少肾移植患者外周血液中CD4+CD2+5Treg数量，且随着FK506浓度增加，

CD4+CD2+5Treg数量逐渐减少。另有研究显示，Foxp3能够通过NFAT途径来控制CD4+CD2+5Treg的增殖及免疫功能［12］，而CaN也可能参与为CD4+CD2+5Treg传导TGF-β1这一生长所必需的信号。可见，作为CaN的环孢素必然会对CD4+CD2+5Treg的增殖及功能造成负面影响。此外，有学者发现，环孢素能够促进CD4+CD2+5Treg的增殖分化。杜美蓉等［13］通过建立小鼠自然流产模型，研究其妊娠及母胎免疫耐受，发现孕鼠妊娠第4天经腹腔注射环孢素可以显著降低其外周免疫细胞对父系抗原的增殖能力与IL-2分泌，并促进脾脏CD4+CD2+5Foxp3+调节性T细胞亚群的扩增，使CD4+CD2+5Treg比例明显高于自然流产组孕鼠，而与正常孕鼠无统计学差异。

综上所述，雷帕霉素可促进CD4+CD2+5Treg的体外增殖，有利于移植后患者免疫耐受的形成;而环孢素则抑制CD4+CD2+5Treg的体外增殖，不利于免疫耐受的形成。

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·基础研究·

收稿日期:( 2015-05-28)

作者简介:第一赵冰清(1986-)，男，住院医师。研究方向为门脉高压的诊治。E-mail: zhaobingqing1986@ hotmall.com

文章编号:1002-266X(2015)34-0019-03

文献标志码:A

中图分类号:R318

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.007