生脉饮(党参方)中5-羟甲基糠醛的分离及其来源探究

颜继忠，陈　岑，楚　楚，李行诺，吴琼琼

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)



生脉饮(党参方)中5-羟甲基糠醛的分离及其来源探究

颜继忠，陈岑，楚楚，李行诺，吴琼琼

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

摘要：为探讨生脉饮(党参方)的物质基础及配伍规律，采用大孔树脂富集结合中压柱色谱纯化，从生脉饮(党参方)中分离得到5-羟甲基糠醛.通过进一步的拆方研究发现：在含五味子的合煎组中，5-羟甲基糠醛的量均较单煎组有明显提高.推测生脉饮(党参方)中麦冬及/或党参与五味子的合煎过程可能会产生5-羟甲基糠醛.首次从生脉饮(党参方)中分离鉴定出5-羟甲基糠醛，同时提供了一种从中药复方中快速分离5-羟甲基糠醛的方法，并对生脉饮(党参方)的配伍规律进行了初步探索.

关键词：生脉饮(党参方)；5-羟甲基糠醛；分离；配伍规律

生脉饮(党参方)是我国古代名方生脉散衍生而来，由党参、麦冬和五味子组成，具有益气、养阴生津之功效，现载于卫生部药品标准中药成方制剂第十册[1].与经典生脉方相比，本方以党参代替人参，行补益肺气之功，更侧重于生津养血[2].现代药理学研究表明：生脉饮(党参方)具有保护心肌，改善心功能，增加冠脉血流量等功效[3].

目前，生脉饮(党参方)的研究报道不多，主要集中于单味药材的化学成分的分离鉴定及质量控制[4-6]，尚未见从生脉饮(党参方)复方中分离纯化化学成分的报道.通过前期研究发现，生脉饮(党参方)中存在一含量较高的成分，但该成分在单味药材中含量极低，推测可能是在复方煎煮过程中产生.为准确鉴定该成分，深入探究生脉饮(党参方)的物质基础，笔者采用大孔树脂富集结合中压柱色谱，对生脉饮(党参方)浸膏进行分离纯化.同时，通过拆方分析对其来源进行分析，为进一步研究生脉饮(党参方)的配伍规律提供依据.

1仪器、材料与试剂

BUCHI Sepacore中压柱色谱(瑞士步琦有限公司)，N2000色谱工作站(赛智科技有限公司)，KQ3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，AR224w电子天平(奥豪斯仪器有限公司)，HH4恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)，Agilent 1260高效液相色谱仪(Agilent Technologies, USA).

党参、麦冬和五味子药材由正大青春宝药业有限公司提供，5-羟甲基糠醛对照品购于成都曼斯特生物科技有限公司(批号MUST-13110805)，D-101大孔吸附树脂(沧州宝恩化工有限公司)，C18填料(YMC﹡GEL ODS-A，孔径120 μm，粒径50 μm).

甲醇(色谱纯，TEDIA)，乙腈(色谱纯，TEDIA)，甲酸(色谱纯，上海阿拉丁试剂有限公司)，乙醇(分析纯，成都市科龙化工试剂厂).

2方法与结果

2.1生脉饮(党参方)中5-羟甲基糠醛的分离鉴定

2.1.1水煎液浸膏的获得

水煎液浸膏由正大青春宝药业有限公司提供，按照卫生部药品标准中药成方制剂第十册生脉饮项下制得[1]，即分别取党参300 g，麦冬200 g，五味子100 g，加水煎煮二次，第一次2 h，第二次1.5 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠浸膏，即得水煎液浸膏.

2.1.2大孔树脂富集

取D101大孔树脂约60 mL，置100 mL烧杯中，用95%乙醇浸泡约24 h，湿法装柱(柱规格为25 mm×420 mm)，以大量蒸馏水洗至流出液无醇味，待用.取2.1.1中生脉饮(党参方)水煎液浸膏适量，加水制成0.17 g/mL的样品溶液，采用经预处理后的D101大孔树脂初步分离，上样后于室温下静吸附1～2 h，先以水洗脱5倍柱体积，除去水溶性杂质，再用30%乙醇10倍柱体积洗脱，流速为1 mL/min，收集30%乙醇洗脱液，回收溶剂，即得大孔树脂富集物100.5 mg，用于中压柱色谱进一步分离.

2.1.3中压柱色谱分离纯化

采用中压柱系统分离，中压柱色谱条件：Buchi Plastic+Glas镀膜色谱柱(49 mm×230 mm)，以C18填料装柱，柱温25 °C，流速20 mL/min，检测器波长254 nm，流动相为V(甲醇)∶V(水)=14∶86.

称取大孔树脂富集物496.9 mg，溶于20 mL体积比为14%的甲醇水溶液中，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液进样，以14%甲醇水溶液洗脱，流速20 mL/ min，紫外检测，波长254 nm，收集色谱图中保留时间25～32 min的馏分，减压浓缩，冷冻干燥，得到浸膏148.8 mg.中压柱色谱图如图1所示.

图1　生脉饮(党参方)分离纯化后的中低压色谱图Fig.1　Chromatogram of Shengmaiyin (Dangshenfang) separation by medium-pressure chromatography

2.1.4化合物鉴定及质量分数测定

所获流分与对照品的液相色谱保留时间一致，外标法测定其质量分数为96.3%(图2).同时，氢谱信号与文献报道一致[7]，主要信号的归属如下：1HNMR(MeOD, 500 MHz)δ：3.33(1H, m, -OH)，4.63(2H, s, -CH2OH)，6.60(1H, d,J=3.5 Hz, Furan-H-4)，7.40(1H, d,J=3.5 Hz, Furan-H-3)，9.55(1H, s, -CHO)，故鉴定该化合物为5-羟甲基糠醛.

图2　5-羟甲基糠醛的高效液相色谱图Fig.2　HPLC chromatogram of 5-hydroxymethylfurfural

2.25-羟甲基糠醛来源探究

2.2.1拆方组样品制备

按卫生部药品标准中药成方制剂第十册生脉饮(党参方)中组方比例，即党参、麦冬和五味子质量比为3∶2∶1，进行拆方研究，设置以下7个拆方组，A：党参3 g，B：麦冬2 g，C：五味子1 g，D：党参 3 g+五味子1 g，E：党参3 g +麦冬2 g，F：麦冬2 g +五味子1 g，G：党参3 g +麦冬2 g +五味子1 g，以上7组拆方药材，分别加20倍水浸泡1 h，置水浴锅回流煎煮，第一次煎煮2 h，过滤；滤渣继续加20倍水煎煮1.5 h，合并滤液，浓缩定容至10 mL，待测.以上各拆方组样品平行制备3份.

2.2.2液相色谱条件

根据本课题组前期研究结果[8]，液相色谱条件：色谱柱为Agilent Extend C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相及梯度洗脱程序如表1所示，流速1 mL/min进样量10 μL，柱温25 °C，检测波长为254 nm.代表性的液相色谱图如图3所示.

2.2.3标准曲线的绘制

称取5-羟甲基糠醛对照品适量，配制成质量浓度为0.431 0 mg/mL的对照品溶液.精密吸取该溶液2，4，8，12，16 μL，稀释25倍的对照品溶液16 μL注入液相色谱，测得峰面积.以进样量x为横坐标、峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为y=1 529.9x+42.6，R2=0.999 9，线性范围是0.172 0～6.896 0 μg.

表1　梯度洗脱程序

2.2.45-羟甲基糠醛来源探究

将2.2.1中制备的7个不同拆方组的样品，按照2.2.2的色谱条件检测，结果见表2.

表2　不同拆方组含有的5-羟甲基糠醛质量的测定结果

3讨论

3.1大孔树脂富集条件及中低压制备色谱条件的优化

采用D101型大孔吸附树脂对目标成分进行富集.对上样液的浓度、流速、洗脱梯度和洗脱剂的体积等因素进行了初步考察，结果表明：上样液浓度为0.17 g/mL，流速为1 mL/min，以30% 乙醇洗脱10倍柱体积为较优的富集条件.

采用中低压制备色谱进行纯化，对中压柱的色谱条件如柱温、流速、流动相和洗脱梯度等进行了考察.较优的中低压制备色谱条件：柱温25 °C，流速20 mL/min，流动相为V(甲醇)∶V(水)=14∶86.

3.2一种快速分离制备5-羟甲基糠醛的方法

采用大孔树脂富集结合中低压制备色谱对生脉饮(党参方)浸膏进行分离纯化，得到5-羟甲基糠醛，这是首次从生脉饮(党参方)中分离获得该物质.同时，此分离制备的策略快速，高效，便捷，溶剂环境友好，提供了一种从中药复方中快速分离制备5-羟甲基糠醛的方法.

3.3拆方研究结果及5-羟甲基糠醛来源分析

实验结果显示，麦冬、五味子和党参中均含有5-羟甲基糠醛，含有的量为麦冬>五味子>党参.而当麦冬或/及党参与五味子合并煎煮后，含有5-羟甲基糠醛的量为麦冬+五味子合煎组>麦冬组+五味子组，党参+五味子合煎组>党参组+五味子组，三味合煎组>党参组+麦冬组+五味子组，而党参+麦冬合煎组<党参组+麦冬组.结果表明：在含五味子的合煎组中，5-羟甲基糠醛的量均较单煎组有明显提高.

5-羟甲基糠醛被认为是中药材及中药复方中常见的成分之一.文献报道其具有神经毒性，损害人体横纹肌及内脏，同时会对眼黏膜、上呼吸道黏膜等产生刺激作用[9].《中国药典》中将其作为中药注射液中的杂质进行严格控制[10].但近年来研究却发现其可能是一种隐藏在单味药及复方背后、尚未被人们认识的活性成分.如有报道称5-羟甲基糠醛也具有抗氧化、改善血液流变学等对人体有益的生物活性[11-12].同时，可能是经典的生脉方——生脉散发挥抗心肌缺血作用的药效成分[13].该成分会产生于中药材的炮制及中药复方的配伍过程中[14-15].其产生的机理通常被认为是由果糖、葡萄糖以及以其为基本结构单元的二糖和多糖热解而得，同时有机酸的加入可以增加高温液态水的酸强度，促进糖类转化成5-羟甲基糠醛的过程[16-17].因此，笔者推测，生脉饮(党参方)中5-羟甲基糠醛可能是由党参或麦冬中的多糖在五味子提供的酸性环境下发生水解产生，但还有待进一步实验研究.

4结论

首次报道了从生脉饮(党参方)中分离制备5-羟甲基糠醛，提供了一种以中药复方为原料制备5-羟甲基糠醛的新途径，而5-羟甲基糠醛作为一种药理活性有争议的物质，其在中成药中的存在与否及含量高低均应引起足够的重视.

参考文献：

[1]国家药典委员会.WS3-B-1911—1995国家药品标准中药成方制剂第十册[S].北京：人民卫生出版社，1995.

[2]黄青萍.生脉饮中人参与党参的薄层鉴别[J].广西中医药，2004，27(1)：57.

[3]沈烈行.生脉饮药理作用与临床应用[J].医药导报，2003，22(9)：634-635.

[4]CHEN Fangfang, QI Huanyang, SHI Yanping, et al. Fingerprint analysis of Codonopsis radix by HPLC coupled with chemometrics analysis[J].Chinese Herbal Medicines，2013，5(4)：307-312.

[5]王进，刘汉清，刘霖，等.HPLC定量指纹图谱法评价川麦冬质量研究[J].中药材，2013，36(5)：721-725.

[6]KIM Y J, LEE H J, KIM C Y, et al. Simultaneous determination of nine lignans from Schisandra chinensis extract using ultra-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry in rat plasma，urine，and gastrointestinal tract samples：application to the pharmacokinetic study of Schisandra chinensis[J].Journal of Separation Science，2014，37 (20)：2851-2863.

[7]刘月新，杜芳麓.5-羟甲基糠醛的合成工艺研究[J].中国现代药物应用，2010，4(1)：3-5.

[8]楚楚，徐绍静，吴琼琼，等.HPLC同时测定生脉饮(党参方)中多组分的含量[J].中药材，2013，36(5)：820-823.

[9]ABRHAM K, GURTLER R, BERG K, et al.Toxicology and risk assessment of 5-hydroxymethylfurfural in food[J].Molecular Nutrition and Food Research，2011，55 (5)：667-678.

[10]张玉玉，宋弋，李全宏，等.食品中糠醛和5-羟甲基糠醛的产生机理、含量检测及安全性评价研究进展[J].食品科学，2012，33(5)：275-280.

[11]ZHAO Ling, CHEN Jianping, SU Jianyu, et al. In vitro antioxidant and antiproliferative activities of 5-hydroxymethylfurfural[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61 (44)：10604-10611.

[12]NAESSBERGER L.Influence of 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF) on the overall metabolism of human blood cells[J].Human and Experimental Toxicology，1990，9(4)：211-214.

[13]朱丹妮，李志明，严永清，等.生脉散复方化学动态变化与药效关系的研究——生脉散复方化学的研究(Ⅱ)[J].中国中药杂志，1998，23(5)：291-293.

[14]ZHANG Lei，ZHU Lin，WANG Yuefei，et al.Characterization and quantification of major constituents of Xue Fu Zhu Yu by UPLC-DAD-MS/MS[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，62：203-209.

[15]刘月新，潘雪，邹茜.探讨5-羟甲基糠醛在中药及复方中的存在意义[J].中国现代药物应用，2013，7(15)：3-5.

[16]张俊姣，张阳，蒋晓燕，等.糖基原料热解形成5-羟甲基糠醛的特性与机理综述[J].新能源进展，2014，2(1)：7-12.

[17]刘昕.高温液态水在有机酸对果糖分解反应动力学的影响[D].杭州：浙江大学，2005.

(责任编辑：陈石平)

Separation and source of 5-hydroxymethylfurfural in

Shengmaiyin (Dangshenfang)

YAN Jizhong, CHEN Cen, CHU Chu, LI Xingnuo, WU Qiongqiong

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Abstract:To investigate the material base and compatibility law of Shengmaiyin (Dangshenfang), macroporous resin column chromatography combined with medium-pressure chromatography were applied to separate the chemical constituents from Shengmaiyin (Dangshenfang). As a result, a kind of constituents was isolated and identified as 5-hydroxymethylfurfural through1HNMR in the present study. Furthermore, the origin of 5-hydroxymethylfurfural was investigated by decomposing recipes of Shengmaiyin (Dangshenfang). The result showed that the content of 5-hydroxymethylfurfural in single drug was much lower than con-decocting of two or three drugs which contained Schisandrae Fructus. It can be concluded that the con-decocting procedure of Codonopsis Radix and/or Ophiopogonis Radix with Schisandrae Fructus may produced 5-hydroxymethylfurfural. Our study presented the first report on isolation of 5-hydroxymethylfurfural from Shengmaiyin (Dangshenfang). In addition, a rapid and effective method was developed to separate 5-hydroxymethylfurfural from Chinese medicinal formula was established. Moreover, the compatibility law of Shengmaiyin (Dangshenfang) was explored.

Keywords:Shengmaiyin (Dangshenfang); 5-hydroxymethylfurfural; separation; law of compatibility

文章编号：1006-4303(2015)04-0379-04

中图分类号：R932

文献标志码：A

作者简介：颜继忠(1964—)，男，福建永春人，教授，研究方向为天然药物有效成份的提取分离与质量控制，E-mail: yjz@zjut.edu.cn.

收稿日期：2015-02-03