鸭疫里氏杆菌分离鉴定及药敏试验

姜自生 （山东省临沂市兰山区畜牧兽医局半城畜牧兽医站 276036）

鸭疫里氏杆菌分离鉴定及药敏试验

姜自生 （山东省临沂市兰山区畜牧兽医局半城畜牧兽医站 276036）

1 试验材料与仪器

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源

病料来源于临沂市太平镇某养鸭场饲养的18日龄病死肉鸭。2015年8月7日。临沂市太平镇某鸭场饲养的18日肉鸭陆续出现发病死亡。病鸭咳嗽。摇头或点头。昏睡。眼鼻流浆性分泌物。脚软。不愿走动。排白色或黄绿色稀粪。剖检见纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎。心包积液。心外膜增厚。颈、胸、腹气囊混浊增厚。内有多量呈絮状或块状的纤维素性渗出物。肝肿大、质脆、呈土黄色或棕红色。脾肿大。小肠粘膜出血。发病率达45%左右。病死率达10%。病初曾用氟苯尼考治疗效果不佳。死亡数逐日上升。

1.1.2 培养基及试剂

普通营养琼脂 （由北京陆桥技术有限责任公司生产）、肉汤培养液 （由北京中海生物科技有限公司生产）、麦康凯琼脂培养基 （青岛高科园海博生物技术有限公司生产）、肠杆菌生化常规微量鉴定管 （由浙江省军区后勤部卫生防疫检疫检验所生产）、猪血清 （由中国兽药检查所生产）枸橼酸钠、蒸馏水等。

1.1.3 药敏试验纸片

由山东农业大学动物科技学院兽医药理教研室提供 （批号 150613）。

1.1.4 试验动物

试验用小白鼠 （18±3g）。由山东医学高等专科学校实验动物中心提供。12日龄肉鸭购于山东六合公司临沂商品肉鸭孵化场。

1.2 试验仪器

DY04-13-44-00压力蒸汽灭菌器桶。SPX-250B-Z型生化培养箱。SW-WJ-LCU洁净工作台。恒温培养箱。SA3000PL光学显微镜。电子天平。电热炉 （中国龙口市先科仪器公司）。常用玻璃器皿等。

2 试验方法

2.1 培养基的制备

2.1.1 麦康凯培养基的制备

用电子天平称取13.5g麦康凯琼脂。溶于盛有250ml蒸馏水的锥形瓶中。在电热炉上加热搅拌至完全溶解。取10个洗净烘干的培养皿。进行分装。每个培养皿倒入20ml麦康凯琼脂溶液。采用高压蒸汽灭菌法。在103.4kPa的蒸汽压下121℃加热20分钟对初步配置的麦康凯培养基进行灭菌。冷却备用。

2.1.2 半固体培养基的制备

用电子天平称取3.8g营养肉汤琼脂。溶于盛有100ml蒸馏水的锥形瓶中。再向锥形瓶中加入0.5g的琼脂粉。在电热炉上加热搅拌至完全溶解。取10个洗净烘干的试管。进行分装。每个试管倒入5ml溶液。高压蒸汽灭菌。冷却备用。

2.1.3 血液培养基的制备

用电子天平称取9.5g营养琼脂。溶于盛有200ml蒸馏水的锥形瓶中。在电热炉上加热搅拌至完全溶解。高压灭菌后待凉至45℃～50℃。然后加入20ml脱纤无菌血。混匀进行分装。避免污染。冷却待用。

2.1.4 肉汤培养基的制备

用电子天平称取1.5g肉汤琼脂。溶于盛有50ml蒸馏水的锥形瓶中。加热搅拌至完全溶解。分装时每个试管倒入5ml溶解的肉汤琼脂。高压蒸汽灭菌后备用。

2.1.5 普通琼脂培养基的制备

用电子天平称取13.5g普通琼脂粉。溶于盛有200ml蒸馏水的锥形瓶中。在电热炉上边加热边搅拌至完全溶解。取洗净烘干的培养皿。进行分装。每个培养皿倒入20ml普通琼脂溶液。采用高压蒸汽灭菌法。在103.4kPa的蒸汽压下121℃加热20分钟对初步配置的普通琼脂培养基进行灭菌。冷却备用。

2.2 分离培养

无菌操作取病料标本。在超净工作台中用灭菌的接种环将病料分别依次接种于麦糠凯培养基、血液琼脂培养基、巧克力培养基、普通琼脂培养基和肉汤培养液。置蜡烛缸内37℃恒温箱中厌氧培养48～72h。观察并记录其生长变化情况[1]。

2.3 培养物涂片染色镜检

取上述培养物涂片。干燥。革兰氏染色及瑞士染色镜检观察。

2.4 运动性观察

在洁净工作台用灭菌的接种针挑取血液培养基可疑菌落。垂直穿入半固体培养基中心接近试管底部。然后迅速沿原路退出。灭菌接种针。将试管置蜡烛缸内37℃生化培养箱中培养24h。观察结果。

2.5 生化试验

取经分离纯化的菌株进行糖发酵试验 （包括葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇）、靛基质试验、甲基红试验、V-P试验、硫化氢试验等。置蜡烛缸内37℃厌氧培养72h以上。观察其生长情况。

2.6 动物致病性试验

取6只小白鼠随机分成试验组。对照组和健康组。试验组小白鼠每只腹腔注射浓度为4×1010CFU/ml的细菌普通血清肉汤培养液0.5ml；对照组的每只小白鼠腹腔注射0.5ml的无菌血清肉汤培养液。观察小白鼠发病死亡情况。将死亡小白鼠心血、肝组织接种于麦糠凯培养基和巧克力培养基。37℃恒温箱中培养24～48h后。涂片、革兰氏染色镜检。观察是否为接种菌株[2]。

2.7 动物回归试验

取健康18日龄肉鸭6只。随机分为试验组和对照组。每组3只。试验组每只腹腔注射接种含菌肉汤0.5ml。对照组腹腔注射同剂量的无菌普通血清肉汤进行对照。观察肉鸭的发病死亡情况。将死亡肉鸭心血、肝组织接种于麦糠凯培养基和巧克力培养基。37℃恒温箱中培养24～48h后。涂片、革兰氏染色镜检。观察是否为接种菌株[3]。

2.8 药敏试验

采用纸片平板扩散法 （K-B法）观察分离菌对20种不同抗菌药物在体外的敏感性。将分离的细菌接种到普通血清肉汤培养基。37℃培养24h后。稀释至菌含量为107个/ml（与标准比浊管比较）。于普通琼脂平板上用稀释的菌液均匀涂布。然后取各种药敏纸片贴附在含菌琼脂平板上。置于37℃培养24h后测抑菌圈直径。根据抑菌圈大小确定菌株对药物的敏感性[6]。

判定标准：抑菌直径＜10mm为耐药；抑菌直径10～15mm为中度敏感；抑菌直径＞15mm为高敏。

3 实验结果及分析

3.1 流行病学、临床病理学诊断结果

根据上述流行病学、临床症状和病理剖检变化。该发病鸭符合鸭传染性浆膜炎的流行特点、临床症状和病理变化特征。可初步诊断为鸭传染性浆膜炎[4]。

3.2 分离培养物的形态特征

该分离菌在普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基上不生长；在血液培养基上长出凸起、闪光、呈奶油状小菌落。不溶血；在巧克力琼脂平板上形成圆形、突起、表面光滑、边缘整齐的半透明、微闪光。直径约1～1.5mm的菌落。符合鸭疫里氏杆菌的生长特性。

3.3 分离培养物涂片染色镜检结果

分离物经涂片革兰氏染色镜检见G-、无芽胞小杆菌。菌体大小为0.2～0.3×1～4μm。单个或成双短小杆菌；经瑞氏染色镜检。细菌两极着色明显。符合鸭疫里氏杆菌的形态特征。

3.4 运动性观察结果

培养物穿刺血清半固体培养基37℃厌氧培养48～72h。培养物沿穿刺线生长。证明该细菌无鞭毛。不能运动。符合鸭疫里氏杆菌的病原特性。

3.5 生化试验结果

分离菌株的生化试验符合鸭疫里氏杆菌的生化特性。该菌不发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、木糖、山梨醇；不产生H2S。不还原硝酸盐；V-P试验和M.R试验均为阴性。靛基质试验、尿酶试验、接触酶试验阳性。

3.6 动物致病性试验结果

试验小白鼠攻毒72h后。小白鼠稍有精神不振。但未发生将死亡。剖杀小白鼠取心血、肝组织接种于巧克力培养基。37℃恒温箱中厌氧培养24～48h后。可回收到此菌。这与鸭疫里氏杆菌的致病特性一致。该菌能致死豚鼠。但不致死家兔和小白鼠。

3.7 动物回归试验结果

试验鸭攻毒24h即出现呼吸增粗、眼肿、眼半闭症状。37h死去1只。未死的2只鸭子消瘦。缩头。毛松。不吃料。不饮水。拉绿色稀粪。眼圈湿。站立不稳。东倒西歪。有时头扭向两侧。至46h这只鸭子亦死亡。对照组3只鸭子全部健活。将死亡鸭子剖检。皆见注射部位发炎。有大量淡黄色较浓稠的渗出物。37h前死亡的1只鸭子见气囊壁轻度浑浊。纤维素性心包炎较明显。3只肝脏皆肿大。色黑红。46h死亡的鸭子见肝脏极度肿大。心包膜、肝被膜、气囊壁表面皆有大量纤维素性渗出物覆盖。腹腔有少量淡黄色腹水。用死鸭心、肝、脑进行细菌培养 （条件同上）和鉴别试验。结果同上。证明试验攻毒菌与自然发病病原菌相同。观察肉鸭的发病死亡情况。将死亡肉鸭心血、肝组织接种于麦糠凯培养基和巧克力培养基。37℃恒温箱中厌氧培养24～48h后。涂片、革兰氏染色镜检。观察与3.2相同。说明分离均为致病菌 [5]。

3.8 药敏试验结果

采用纸片平板扩散法 （K-B法）观察分离菌对不同抗菌药物在体外对分离菌的敏感性。结果分离菌对头孢曲松、头孢噻呋、痢菌净高敏；对左氧氟沙星、丁胺卡那霉素、氨苄青霉素、环丙沙星中度敏；对氟苯尼考、庆大霉素、安普霉素、恩诺沙星、新霉素、阿莫西林等产生了广泛的耐药。

4 讨论

（1）鸭传染性浆膜炎容易与大肠杆菌病和巴氏杆菌病混淆。有时还会与鸭沙门氏菌病及鸭衣原体病混淆。不能轻易地作出诊断。同时还要注意几种病原混合感染的可能性。注意多种病菌混合感染。单从临床症状或病理变化难以确诊。必须结合实验室诊断方可确诊。避免误诊影响疫情控制。

（2）本试验检测了该场鸭疫里氏杆菌对20种药物的敏感性。试验表明头孢曲松、头孢噻呋、痢菌净高敏；对氟苯尼考、庆大霉素、安普霉素、恩诺沙星、新霉素、阿莫西林等产生了广泛的耐药。当然药物的治疗效果还因不同鸭场而有所差异。如果长期使用同一种药会产生耐药性。建议各鸭场在防治传染性浆膜炎时。注意交替使用药物。

（3）该鸭场根据药敏试验结果选用了头孢噻呋。10g/100kg水混饮。连用3天。病情基本治愈。直到现在未见复发。说明实际应用和试验结果基本一致。

（4）鸭疫里氏杆菌极易产生耐药性。由于抗菌药物的长期滥用。有些常用抗菌药物敏感性降低。甚至产生耐药。因此最好结合药敏试验结果。选择敏感的药物治疗。并注意轮换交替用药。减少耐药性的产生。提高临床用药的有效性。

（5）无论是采用药物还是使用菌苗来预防鸭传染性浆膜炎。都不是防治此病的根本方法。要想减少或杜绝鸭传染性浆膜炎的发病率。必须采取加强饲养管理、搞好环境卫生、严格消毒等综合防治措施才行[6]。防治该病应加强饲养管理。搞好环境卫生。对水域进行经常性消毒。本病受到应激因子如寒冷刺激的影响很大。其他传染病如大肠杆菌病等均可引起本病的暴发或加剧病鸭死亡。所以要加强鸭场的综合防治和免疫预防工作。

（6）疫苗的预防接种是防治鸭传染性浆膜炎较为有效的措施。近年来。国内外学者致力于RA疫苗的研究。目前国内常用的疫苗有油乳剂灭活苗、铝胶灭活苗和弱毒活菌苗三种。此外。RA亚单位抗原疫苗正在进行实验室攻毒保护试验、免疫期测定及田间试验。效果良好。高福等在研制RA福尔马林灭活苗的基础上。制得了矿物油佐剂灭活苗。最低保护率为75%[7]。

（7）鸭疫里氏杆菌感染后对免疫器官脾脏和法氏囊及对血液中免疫球蛋白的影响严重。尤其是降低其体液免疫应答。因此要加认识注意防治[8]。

综上所述。实验室诊断、药物防治和疫苗预防是有效地防治鸭传染性浆膜炎三大环节。药物防治是当前切实有效的方法。在确定不同地区流行菌株的血清型及其分布基础上的疫苗预防则是简便、低廉和有效的措施。深入进行RA表面抗原的研究。研制基因工程苗。是解决因RA血清型不同等原因造成疫苗效果不佳问题的必由之路。

[1]韩文瑜,何昭阳,刘玉斌.病原细菌检验技术[M].吉林:吉林科学技术出版社,1992,7:79-83.

[2]赵坤,王三虎,刘诗柱,等.豫北地区猪源致病性大肠杆菌分离与鉴定[J].河南科技学院学报(自然科学版),2007,35(3):25-27.

[3]邓治邦,朱深海,杨丽君,等.鸭传染性浆膜炎的诊断与防治[J].中国预防兽医学报,2000,22(3):226-228.

[4]闻勇.副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验[J].中国畜禽种业,2013(7):15.

[5]孙申菊.雪山鸡多杀性巴氏杆菌的分离鉴定与药敏试验[J].畜禽业,2015(4):15.

[6]杨永刚,刘海霞,孙齐田,等.鸭传染性浆膜炎蜂胶灭活苗的研制及免疫效果试验[J].中国家禽,2006,28(9)23-24.

[7]郑腾,李昂,陈枝华.鸭传染性浆膜炎的诊断和防治现状及进展[J].中国家禽,2002,24(21):40-43.

[8]黎晓敏,陈思怀,朱周福.传染性浆膜炎对鸭免疫功能的影响[J].四川畜牧兽医学院学报,2002,16(3):1-5.