三氧化二砷对VEGF诱导人骨肉瘤SaOS-2细胞TRAF-2和STAT-6表达的影响

吴永辉林 晓罗冬娇钟永翔王恩智王鑫华

三氧化二砷对VEGF诱导人骨肉瘤SaOS-2细胞TRAF-2和STAT-6表达的影响

吴永辉1林 晓1罗冬娇2钟永翔1王恩智1王鑫华1

目的通过观察三氧化二砷（As2O3）对血管内皮生长因子（VEGF）诱导人骨肉瘤SaOS-2细胞肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF-2）和信号转导子与转录激活子（STAT-6）表达的影响，探讨As2O3治疗骨肉瘤的作用机制。方法分别采用CCK8法、实时荧光定量PCR法和流式细胞术测定细胞生长抑制率、TRAF2和STAT-6的表达。结果2μmol/L的As2O3对SaOS-2细胞的生长抑制率达57%（0.57±0.03比0）（P＜0.01），使VEGF诱导作用显著降低（0.42±0.02）（P＜0.05），TRAF-2及STAT-6的表达也显著下降（分别为：149.00±7.21比167.33±8.02；1.29±0.12比2.53±0.67）（P均＜0.05）。结论As2O3可能通过TRAF-2和STAT-6途径对SaOS-2细胞的生长呈剂量相关的抑制作用。

骨肉瘤；SaOS-2细胞；As2O3；TRAF-2；STAT-6;VEGF

骨肉瘤是一种起源于间叶组织最常见的骨骼系统恶性肿瘤，多数病例在原发灶较小的早期即发生广泛的转移，病情凶险，进展迅速，其发病机制至今尚未完全清楚。研究表明，骨肉瘤的发生、发展、预后与炎症因子及凋亡的异常表达密切相关。最近研究发现，肿瘤坏死因子受体（TNF-R）相关因子（TRAF）和信号转导子与转录激活子（STAT）参与了癌症的发病过程[1]，但它们在骨肉瘤发病机制中所起的作用如何国内报道甚少。三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）被认为是一种低毒、有效的化疗药物，已在Ⅲ期成骨肉瘤、尤文肉瘤患者取得较好的近期临床疗效[2]，但其具体机制不清。本研究通过观察血管内皮生长因子（vascular endotheilial growth factor，VEGF）诱导SaOS-2人骨肉瘤细胞TRAF-2和STAT-6表达及As2O3对其表达的影响，探讨As2O3治疗骨肉瘤的机制，为临床治疗提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 SaOS-2细胞株购于上海细胞所，VEGF购于PROSPEC公司，一抗TRAF2抗体购于abcam公司（批号ab12122），注射用As2O3由北京双鹭药业股份有限公司产生（批号20130304）。

1.2 细胞培养及分组 复苏SaOS-2人骨肉瘤细胞，细胞在1640培养基（含青霉素、链霉素和10%胎牛血清）（购于gibco公司），置于37℃、5%CO2培养箱（型号3111，Thermo公司生产）中培养，使用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，0.25%胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养并调整细胞状态。接种于6孔细胞培养板，分别给予VEGF（10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL）（命名为 V10组、V50组、V100组）、As2O3（1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L）（分别命名为 A1组、A2组、A4组）、VEGF 100ng/mL联合As2O3 2μmol/L（命名为A2+100组）及细胞对照组（不加VEGF或As2O3）。

1.3 CCK-8 检测：取生长对数期细胞，细胞浓度为3.5×103/孔，加药后继续置于5%CO2培养箱培养48h。使用CCK-8检测各组细胞的吸光度（OD）值，具体操作方法按说明书进行。每组分别做3次平行实验，每孔细胞重复3次检测取其平均值，并设空白组调整。细胞生长抑制率=（对照组的OD值-样品组的OD值）/对照组的OD值×100%，细胞活力=样品组的OD值/对照组的OD值×100%。

1.4 总RNA提取和实时荧光定量PCR法（RT-qPCR）测定STAT-6表达 调整细胞密度为每孔2× 105个，细胞加药培养48h后，将细胞消化收集，加入Trizol 1mL裂解细胞提取总RNA（购自Generay公司，批号1305G09），取2μL RNA溶液于Merinton SMA4000检测，观察A260/A280、A260/A230比值及连续波长吸收峰，并计算RNA溶液浓度，判断RNA提取质量：A260/A280＞2.0且＜2.3，则可以满足后续RT-qPCR所需。并逆转录成cDNA（逆转录试剂盒购自Fermentas公司，批号00141145），实时荧光定量PCR的方法检测STAT-6的表达（qPCR试剂Super-Real Premix Plux购自TIANGEN公司，批号#M2029）。引物序列（由上海捷瑞公司合成）如下：STAT-6的上游引物5’-GGCAACCAAGACAACAATG-3’，下游引物5’-：TGCTGATGAAGCCAATGAT-3’，PCR产物大小为385bp；内参GAPDH的上游引物5’-AGAAG GCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物5’-AGGGGCCA TCCACAGTCTTC-3’，PCR产物大小258bp。实验步骤参照说明书进行。反应条件如下：50℃ 3min、95℃15min、95℃ 10s、59℃ 20s、72℃ 30s（40循环）、95℃10s（融解曲线），退火温度为60度。每个样本重复3次试验，通过观察样本扩增曲线和熔解曲线了解实验情况，同时进行内参基因GAPDH检测（定量PCR仪为CFX connect Real-Time PCR System），结果分析采用比较 CT值法：△CT实验组/对照组= CTSTAT-6-CTGAPDH，△△CT=△CT实验组-△CT对照组，基因相对表达量（RQ）采用2-△△CT方法计算。

1.5 流式细胞术法测定TRAF-2表达 收集加药后细胞，PBS洗涤细胞两遍，1500rpm离心10min（台式低速离心机：80-2型，上海医疗器械有限公司生产），4%多聚甲醛室温固定30min，PBS洗涤细胞两遍，同上离心后，0.1%曲拉通室温破膜30min，再次如上离心，10%BSA室温封闭30min，离心弃封闭液，以100μl 10%BSA重悬细胞，加入0.2μg TRAF2抗体（0.1μg/105个细胞），室温孵育30min，PBS洗涤细胞二遍，离心后沉淀物以100μL 10%BSA重悬细胞，加入0.2μg FITC-荧光二抗（0.1μg/105个细胞），室温避光孵育30min，PBS洗涤细胞二遍，1500rpm离心10min，500μL PBS重悬细胞，上机检测（Accuri C6流式细胞仪由BD公司生产），门内收集5000个细胞，记录平均荧光强度（meanfluorescence intensity，MFI）。另设空白对照组（不加抗体，其他处理同上）。

1.6 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件分析，数据以均数±标准差（±s）表示。组间样本均数比较采用单因素方差分析，Levene法检验方差齐性。多组间两两比较方差齐时应用LSD-t检验，方差不齐时应用Dunnett T3检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 骨肉瘤细胞活力及细胞生长抑制率 CCK-8细胞活力分析显示，V100组细胞生长活力显著高于对照组（P＜0.05），V50组、V10组的细胞生长活力与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。A2组、A4组细胞生长抑制率显著高于对照组（P均＜0.01），A1组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。A2+100组细胞生长抑制率显著低于A2组（P＜0.05），见表1-2。

表1 VEGF诱导SaOS-2人骨肉瘤细胞生长活力（±s）

表1 VEGF诱导SaOS-2人骨肉瘤细胞生长活力（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别对照组V10组V50组V100组浓度（mg/mL）0 10 50 100株数3 3 3 3细胞活力1 1.12±0.07 1.14±0.05 1.50±0.10*

表2 As2O3对SaOS-2人骨肉瘤细胞生长抑制率（±s）

表2 As2O3对SaOS-2人骨肉瘤细胞生长抑制率（±s）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与A2组比较，△P＜0.05

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2.2 STAT-6 mRNA表达 RT-qPCR检测结果显示，目的基因的熔解曲线均为单一峰，熔解温度为87.5℃。V100组STAT-6 mRNA表达水平显著高于对照组（P＜0.05），A2+100组显著低于V100组（P＜0.05），见表3。

表3 各组STAT-6 mRNA和TRAF-2蛋白表达水平比较（±s）

表3 各组STAT-6 mRNA和TRAF-2蛋白表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与V100组比较，▲P＜0.05

组别对照组V100组A2+100组株数3 3 3 STAT-6 RQ值（2-△△CT）1 2.53±0.67* 1.29±0.12▲TRAF-2（MFI值）136.33±6.11 167.33±8.02** 149.00±7.21▲

2.3 TRAF-2蛋白表达 流式细胞术结果显示，V100组TRAF-2蛋白的表达水平显著高于对照组（P＜0.01），A2+100组显著低于V100组（P＜0.05），见表3、图1。

图1 流式细胞术检测TRAF-2蛋白表达水平

3 讨 论

TRAF家族是一种细胞内没有死亡域结构的TNF-R超家族成员之一，最初作为直接结合胞质区TNF-R超家族的信号接头，也具有E3泛素连接酶的活性并激活下游区的信号靶点。依赖TRAFs激活的具有代表性的信号通路为NF-κBs、胞外信号调节激酶激酶（MAPKs）和干扰素调节因子（IRFs）[3]。它具有重要的生理作用，能调节天然和获得性免疫、胚胎发育、组织动态平衡、应激反应、骨新陈代谢、炎症及肿瘤等疾病[4-5]。抑制TRAF-2介导的NF-κB的活性可促进核转录因子激活蛋白质1（AP-1）的产生，通过调节TRAF-2的途径可作为抗癌和抗炎的治疗药物[6]。研究[7]发现，TRAF-2和谷胱甘肽转移酶以复合物的形式激活允NK及P38信号通路，参与人骨肉瘤细胞的凋亡和细胞周期阻止。本研究发现，加入VEGF后人骨肉瘤细胞TRAF-2的表达增加，提示VEGF能诱导人骨肉瘤细胞增加分泌TRAF-2，推测VEGF可能通过TRAF-2的途径促进骨肉瘤的进展。

STAT家族是一种存在于胞浆并在激活后能够转入核内与DNA结合的蛋白家族，具有信号转导和转录调控双重功能。广泛表达于机体不同类型的细胞和组织中，参与细胞生长、分化、凋亡等多种生理功能的调控，并与炎症、肿瘤和免疫反应关系密切。其机制可能通过允AK/STAT信号通路参与骨肉瘤细胞的增殖、移行和侵袭[8]。研究[9]发现骨肉瘤STAT-3阳性表达率明显高于骨软骨瘤，且与是肺转移及Enneking分期有关，认为STAT-3与骨肉瘤的恶性程度及转移有关；可能是STAT-3的过度激活抑制了肿瘤细胞凋亡，从而促进骨肉瘤的发生发展。本研究发现，加入VEGF后人骨肉瘤细胞STAT-6的表达增加，提示VEGF能诱导人骨肉瘤细胞增加分泌STAT-6，推测VEGF可能通过STAT-6的途径促进骨肉瘤的进展。

本研究进行CCK8检测发现，V100组显著高于V50组及对照组，V50组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），提示100ng/mL的VEGF对细胞增殖有促进作用；A2组、A4组显著低于对照组，A1组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），提示低浓度（1μmol/ L）As2O3对细胞无明显作用，中浓度（2μmol/L）和高浓度（4μmol/L）有明显抑制作用。故本研究采用100ng/mL VEGF联合2μmol/L As2O3，观察As2O3的治疗作用。

以往研究发现，1μmol/L以上浓度的As2O3可明显地抑制MG-63骨肉瘤细胞增殖，抑制率可达70%，细胞呈典型的凋亡改变，c-myc mRNA被明显抑制，细胞周期阻滞于G2/M期[10]。在胃癌细胞系也取得相似的结果[11]。本研究发现，CCK8细胞活力分析显示，A2组、A4组骨肉瘤细胞的抑制率高于对照组，而A1组与对照组无差异。提示1μmol/L的As2O3对骨肉瘤细胞增殖抑制作用不明显，但随着作用浓度增加，细胞生长抑制效应逐渐增强，具有一定的量-效关系。A2+100组的细胞抑制率、TRAF-2 和STAT-6低于A2组，提示2μmol/L的As2O3能抑制VEGF对骨肉瘤细胞的诱导作用，推测As2O3对骨肉瘤具有一定的治疗作用。

综上所述，As2O3能抑制 VEGF对骨肉瘤SaOS-2细胞的诱导作用，2μmol/L的As2O3浓度能抑制骨肉瘤SaOS-2细胞的活力、TRAF-2和STAT-6的表达。

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（收稿：2015-08-13 修回：2015-10-07）

Effects of Arsenic Trioxide on the Expression of TRAF-2 and STAT-6 on Human Osteosarcoma SaOS-2Cell Line Induced by VEGF

WU Yonghui1,LIN Xiao1,LUO Dongjiao2,ZHONG Yongxiang1,WANG Enzhi1, WANG Xinhua1. 1 Department of Osteology(WU Yonghui,LIN Xiao,ZHONG Yongxiang),Department of Clinical Laboratory(WANG Enzhi,WANG Xinhua),Intergated Chinese and western Medicine Hospital of Taizhou,Taizhou (317523),China;2 Department of Laboratory Medicine,Medicine College of Hangzhou Normal University,Hangzhou (311121),China

ObjectiveTo investigate the effect of arsenic trioxide（As2O3）on the expression of tumor necrosis factor receptor-associated factor 2（TRAF-2）and signal transducer andactivator of transcription 6（STAT-6）on human osteosarcoma SaOS-2 cell line induced by vascular endothelial growth factor（VEGF）,in an attempt to explore the mechanism of As2O3 treating human osteosarcoma.MethodsCCK8 assay,real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（QRT-PCR）and flow cytometry methods were used to determine the inhibition rate and expression levels of TRAF-2 and STAT-6 on osteosarcoma SaOS-2 cell line after treatment with As2O3.ResultsTreated with As2O3 of 2 μmol/L,the inhibition ratio of SaOS-2 cell line reached 57%（0.57±0.03 vs 0, P＜0.01）and the induction function of VEGF was notably depressed（0.42±0.02,P＜0.05）.The expression levels of TRAF-2（149.00±7.21 vs 167.33±8.02）and STAT-6（1.29±0.12 vs 2.53±0.67）significantly decreased（all P＜0.05）.ConclusionThe inhibition function of As2O3 on osteosarcoma cell proliferation is in a dose-dependent manner, which may be related to TRAF-2 and STAT-6 pathway.

osteosarcoma;SaOS-2 cell line;arsenic trioxide;tumor necrosis factor receptor-associated factor 2; signal transducer andactivator of transcription 6;vascular endothelial growth factor

浙江省自然基金资助项目（No.LY13H080006）；浙江省温岭市科技局基金资助项目（No.2013-1-64）

1浙江省台州市中西医结合医院骨科（吴永辉、林晓、钟永翔）、检验科（王恩智、王鑫华）（台州 317523）；2杭州师范大学医学院检验系（杭州 311121）

林晓，E-mail：linxiaozg@163.com