人诱导多能干细胞重编程过程中长链非编码RNA的差异表达研究

俞茜，刘雅丽，范勇

人诱导多能干细胞重编程过程中长链非编码RNA的差异表达研究

俞茜，刘雅丽，范勇△

摘要：目的探讨人诱导多能干细胞重编程过程中长链非编码RNA（lncRNA）的表达改变及其作用。方法利用Agilent Human lncRNA（4×180K）芯片检测人体细胞、诱导多能干细胞以及胚胎干细胞中lncRNA的表达情况。通过数据分析比较人体细胞诱导为多能干细胞后lncRNA的差异表达，筛选出在重编程过程中可能发挥作用的lncRNA。结果人诱导多能干细胞lncRNA表达谱类似于胚胎干细胞而与体细胞不同。通过聚类分析发现诱导多能干细胞与体细胞之间有3 156个差异表达lncRNA。通过生物学分析发现人体细胞诱导为多能干细胞重编程过程中有222个差异表达的lncRNA。结论lncRNA在人诱导多能干细胞重编程过程中可能发挥着重要的作用。

关键词：多能干细胞；核重编程；芯片分析技术；长链非编码RNA

长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸、不编码蛋白质的非编码RNA［1］。起初该类RNA被认为是转录垃圾或者是RNA聚合酶Ⅱ杂乱行为［2］。而近年来的研究表明，lncRNA在细胞生物、生理、病理过程中扮演着重要的角色，参与调节细胞的生长、分化、代谢以及凋亡［3］。lncRNA与肿瘤的发生发展有着不一样的关系，它们通过参与基因的表达调控或促进或抑制肿瘤的发展［4-5］。lncRNA在小鼠胚胎干细胞的分化过程中表现出表达差异性［6］，同时多种多能性相关转录因子也对其进行调控［7］。另一方面，lncRNA也参与调节多种成体干细胞的自我更新以及分化能力［8］，lncRNAs Xist就在造血干细胞长期生存中发挥着不可替代的作用［9］。

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）是将转录因子体外转入到分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种多能性细胞状态［10］。分子表观遗传修饰分析表明，在细胞重组期间，几乎重构了整个表观基因组，最终获得与胚胎干细胞非常类似的蛋白表达以及miRNA基因表达谱的多能干细胞［11-12］。目前对细胞重编程过程尤其是诱导多能干细胞过程中lncRNA的研究还非常有限。有研究发现，在重编程过程以及小鼠和人类的胚胎干细胞中存在特异性的 lncRNA，这些lncRNAs与重编程重要因子OCT4、NANOG以及SOX2表达有很大相关性［6］。lncRNA会影响细胞的重编程过程，重编程调节lncRNA（lncRNA-ROR）是一种发挥了重要调控作用的重编程编码调控器，抑制他们的表达会降低细胞的重编程效率［13-14］。但是lncRNA在这期间的变化还不是很明确。

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81370766）

作者单位：广州，广州医科大学附属第三医院，广东省产科重大疾病重点实验室（邮编510150）

作者简介：俞茜（1990），女，硕士在读，主要从事干细胞与生殖方面的研究

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通讯作者E-mail：yongfan011@gzhmu.edu.cn

本研究利用Agilent Human lncRNA（4×180K）芯片，比较重编程前后人体细胞和诱导多能干细胞之间lncRNA的表达差异，获得在重编程过程中差异表达lncRNA，通过生物信息学分析找出可能在重编程过程中发挥重要作用的lncRNA。

1　材料与方法

1.1材料本研究使用的A966、17-17、ips-G、ips-A966-9、ips-A966-11、hES10细胞系均来自本实验室前期自主建系，建系方法详见之前的实验工作［15］。其中A966为羊水细胞，ips-A966-9、ips-A966-11为由A966诱导而来的诱导多能干细胞。17-17为皮肤成纤维细胞，ips-G为由17-17诱导而来的诱导多能干细胞。hES10为胚胎干细胞。

1.2方法

1.2.1细胞培养方法羊水细胞的培养液为商品化的AmnioMAX-TM-II（GIBCO）培养基。皮肤成纤维细胞的培养基为含高糖的 DMEM培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，Invitrogen），添加10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、1%双抗（青霉素/链霉素，Pen/Strep）。人诱导多能干细胞以及胚胎干细胞培养在铺有matrigel的培养皿上，用mTeSR1培养基培养，每天换液至可细胞传代或可收集。细胞每4～5 d用EDTA消化传代。所有细胞均培养在37℃，5%CO2培养箱中。

1.2.2总RNA提取当细胞长到80%的密度时，收集细胞使用 mirVanaTM RNA Isolation Kit（Applied Biosystem p/n AM1556）提取Total RNA，详细步骤参见使用说明书。

1.2.3获取cRNA用于芯片分析按照步骤进行以下实验，提取的总RNA的纯化（QIAGEN RNeasy®Mini Kit），cDNA第一链和第二链一步法合成，荧光标记cRNA合成，cRNA纯化（QIAGEN RNeasy®Mini Kit），cRNA浓度测定，cRNA样品片段化和芯片杂交（4×180K microarrays），芯片洗涤，Agilent扫描仪中扫描。详细步骤参照Agilent芯片分析方法要求。

1.2.4分析数据及作图软件利用Agilent Human lncRNA （4×180K）芯片对2株人体细胞系、3株人诱导多能干细胞系以及1株人胚胎干细胞系进行lncRNA表达谱芯片检测，以了解lncRNA在人体细胞重编程过程中的变化。对人体细胞、诱导多能干细胞与胚胎干细胞之间表达差异的lncRNA进行了进一步整合分析。Feature Extraction软件读取数据Scan resolution 5 μm，PMT 100%，采用Feature Extraction进行处理分析。最后应用GENESPRING12.0进行分位数标准化（Quantile normalization）。

2　结果

2.1各细胞系主成分分析（PCA）及基因表达谱聚类分析主成分分析结果显示，体细胞羊水细胞A966与皮肤成纤维细胞17-17成分类似，而由其诱导而来的诱导多能干细胞ips-A966-9、ips-A966-11、ips-G则与胚胎干细胞hES10类似，见图1A。通过Agilent Human lncRNA（4×180K）芯片结果聚类分析发现人体细胞与诱导多能干细胞之间存在4 031个基因的差异表达（表达差异大于2倍）。基因表达谱聚类分析显示，3株人诱导多能干细胞系在基因表达方面更类似于胚胎干细胞而与其对应的体细胞不同，见图1B。

2.2人体细胞与诱导多能干细胞之间lncRNA表达谱聚类分析表达谱聚类分析结果显示，人体细胞与诱导多能干细胞之间存在3 156个lncRNA的差异表达。3株人诱导多能干细胞在lncRNA表达谱方面类似于人胚胎干细胞而与人体细胞不同，见图2。

2.3人体细胞诱导为多能干细胞重编程过程中lncRNA表达差异分析整合分析结果显示，ips-A966-9、ips-A966-11与A966有6 965个lncRNA差异表达，ips-G与17-17有7 929个lncRNA差异表达，ips-A966-9、ips-A966-11和ips-G与hES10共有1 038个lncRNA差异表达。为了进一步筛选出可能与重编程有关的lncRNA，笔者分析得出ips 与hES10，ips-A966-9、ips-A966-11与A966，ips-G 与17-17之间的差异表达lncRNA，最后取三者共有的差异lncRNA并取交集，结果显示3对共有222个差异表达的lncRNA，见图3。这些差异表达的lncRNA在维持干细胞多能性及诱导体细胞重编程过程中可能发挥重要作用。

3　讨论

哺乳动物基因组编码大量的lncRNA，但大部分lncRNA的功能目前为止还不是特别明确。已有研究表明，lncRNAs在维持胚胎干细胞的多能性方面发挥着重要作用，且它们通过与核蛋白相互作用来发挥生物学功能［13］。重编程是在体细胞里过表达相关多能性基因使其转变成类似于胚胎干细胞的过程。在这个过程中，基因表达发生了很大的变化，与此同时，lncRNA是否会发生变化呢？笔者利用Agilent Human lncRNA（4×180K）芯片比较人体细胞重编程为诱导多能干细胞后lncRNA的表达谱变化。为了确定各样本之间的联系以及实验的合理性，笔者对在本研究用到的细胞系进行主成分分析。发现人体细胞重编程为诱导多能干细胞后，lncRNA的表达发生了巨大变化。基因表达谱结果证实本研究使用的人诱导多能干细胞在基因表达方面表现出与胚胎干细胞相似的特性。lncRNA聚类分析显示诱导多能干细胞与诱导前的体细胞间lncRNA是有表达差异的，诱导多能干细胞的lncRNA表达更类似于胚胎干细胞。通过生物信息学分析发现，在诱导多能干细胞与体细胞和胚胎干细胞的差异比较中有222个lncRNA的共有差异表达，这从侧面反映了lncRNA可能在重编程过程中发挥重要作用。

本研究通过芯片数据分析得出lncRNA在重编程过程中表达是有发生变化的，但其是通过什么来作用以及怎么发挥作用的还不明确。已有研究表明，在建立以及维持多能性方面，染色质重塑复合物起着至关重要的作用，而大量的lncRNA能够通过与染色质重塑复合物相互作用来调控目标基因的表达［16-18］。本研究分析得出的人体细胞重编程为诱导多能干细胞差异表达lncRNA为进一步研究其在干细胞多能性基因调控网络中的作用提供了新的思路。

致谢：感谢上海欧易生物医学科技有限公司在芯片数据分析方面提供的帮助。

（图1～3见插页）

参考文献

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（2016-03-09收稿2016-04-17修回）

（本文编辑魏杰）

中图分类号：Q28

文献标志码：A

DOI：10.11958/20160135

Studies on the long non-coding RNA during the reprogramming of human pluripotent stem cells

YU Qian,LIU Yali,FAN Yong△
Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province,The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510150,China
△Corresponding AuthorE-mail:yongfan011@gzhmu.edu.cn

Abstract:ObjectiveTo investigate the changes and roles of the long non-coding RNA（IncRNA）during the reprogramming of human induced pluripotent stem cells.MethodsAgilent Human lncRNA(4×180K)chip was used to check the expression of lncRNA in somatic cells,induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.Compared with differentially expressed lncRNA in somatic cells and induced pluripotent stem cells,lncRNA was selected that may play an important role during the reprogramming of human pluripotent stem cells.ResultsThe lncRNA expression profiles in induced pluripotent stem cells were similar to embryonic stem cells,but were different from the somatic cells.A total of 3 156 differentially expressed lncRNAs were found between stem cells and somatic cells by cluster analysis,and 222 differentially expressed lncRNAs were found during the reprogramming process of human pluripotent stem cells by biological analysis.ConclusionlncRNA may play an important role in reprogramming process of human pluripotent stem.

Key words:multipotent stem cells;nuclear reprogramming;microchip analytical procedures;long non-coding RNA