RhoA/Rho激酶信号通路在慢性疼痛中的作用

丘玥，魏敏，王之遥，黄宇光

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院麻醉科，北京100730

RhoA/Rho激酶信号通路在慢性疼痛中的作用

丘玥，魏敏，王之遥，黄宇光

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院麻醉科，北京100730

慢性疼痛;Rho蛋白;Rho激酶;抑制剂;镇痛

RhoA是一种小分子G蛋白，RhoA的主要效应底物Rho激酶(Rho-associated coiled-coil-forming kinases，ROCK)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，主要在细胞迁移、分化和生存等方面起重要作用［1］。RhoA/ROCK的异常激活可在很多疾病中被观察到，如中枢神经系统疾病、心血管疾病、肿瘤等。目前大量研究表明，RhoA/ ROCK通过其介导的细胞信号传导系统在慢性疼痛中也发挥着重要作用。本文通过阐述RhoA/ROCK信号通路在慢性疼痛中的作用机制，为临床治疗疼痛提供新的思路和策略。

RhoA/Rho激酶通路

Rho GTP酶

Rho GTP酶是Ras GTP酶超家族的一个亚家族，通过在失活(GDP-结合)和激活(GTP-结合)状态间的转换精确调控多条信号通路。其在激活和失活状态间的转换主要由以下几类蛋白调控:GTP酶激活蛋白(GTPase-activating proteins，GAPs)、鸟嘌呤核苷酸转换因子(guanine nucleotide-exchange factors，GEFs)和鸟嘌呤核苷酸分离抑制因子(guanine nucleotide-dissociation inhibitors，GDIs)。GAPs主要增强内源性GTP酶的活性，GEFs主要催化GDP结合态到GTP结合态的转换，GDIs则将GTP酶以GDP结合的失活状态隔绝在胞浆内。

其中，RhoA是小分子G蛋白家族的一个成员，在许多细胞功能中起到重要作用，包括细胞骨架重排，细胞运动、吞噬、转运和转录的调控以及细胞的生长［2］。

Rho激酶

ROCK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要有2种异构体:ROCKⅠ和ROCKⅡ。2种异构体在总氨基酸序列上有约65%的重叠，其中激酶端重叠达92%。尽管两种异构体在蛋白序列上高度相似，组织分布却有所不同。ROCKⅠ主要表达在非神经组织中，如心脏、肺、骨骼肌，而ROCKⅡ则主要在脑组织中高表达［3］。

ROCK的活性受起C端负性调节，在失活状态下，C端区域反折遮盖激酶区，从而形成自身抑制的环形结构［4］。当GTP结合状态的Rho与ROCK的相应区域结合时，ROCK的自身抑制状态改变，从而激酶活化。其他可激活ROCK的信号包括花生四烯酸、鞘氨醇磷脂等，它们对ROCK的激活不依赖Rho蛋白［5］。

ROCK的激活主要通过对目标蛋白的磷酸化。其中一个主要的底物是肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)。RhoA/ROCK介导的MLC磷酸化引起肌球蛋白与肌动蛋白相互作用，从而引起细胞骨架重排等一系列改变［6］。此外，ROCK可以通过使MLC磷酸酶失活从而间接调节MLC磷酸化的量。ROCK的其他底物包括丝氨酸/苏氨酸激酶LIM激酶1和2［7］、中间丝蛋白(例如波形蛋白、胶质原纤维酸性蛋白、神经丝)、微管相关蛋白2(microtubule-associated protein，MAP2)、tau蛋白和脑衰蛋白反应调节蛋白2 (collapsin response mediator protein 2，CRMP2)等。

RhoA/Rho激酶通路抑制剂

Fasudil和Y-27632是最早发现的ROCK抑制剂，主要通过拮抗细胞内钙发挥作用。考虑到不同ROCKⅠ和ROCKⅡ序列的高度相似性，目前还没有ROCK选择拮抗剂。此外，H-1152、AS1892802等较强的ROCK拮抗剂也在基础研究中广泛应用。

HMG-CoA还原酶抑制剂对RhoA/ROCK通路也有抑制作用。HMG-CoA还原酶抑制剂调节了许多小分子G蛋白的功能，例如Ras、Rho、Rab、Rac、Ral和Rap［8］。以往研究表明，他汀类药物通过抑制HMGCoA还原酶活性，降低了类异戊二烯的含量。类异戊二烯是包括小GTP结合蛋白的许多蛋白质转录后修饰中一种重要的脂质连接物质，可协助这些蛋白质从胞质到胞膜的转位。甲羟戊酸是类异戊二烯的前体，为验证类异戊二烯在小分子G蛋白激活中的作用，Ohsawa等［9］发现鞘内注射甲羟戊酸可诱发热痛敏;鞘内预注射ROCK抑制剂Y-27632可完全拮抗甲羟戊酸诱发的热痛敏，而甲羟戊酸诱发热痛敏仅可被尼基转移酶抑制剂FTI-277部分拮抗。进一步研究发现，鞘内注射甲羟戊酸可增加脊髓内RhoA从胞质到胞膜的转移，而用HMG-CoA还原酶抑制剂辛伐他汀可缓解福尔马林诱导的二相疼痛反应。

RhoA/Rho激酶通路与疼痛

在神经系统中，RhoA信号的活化参与了突触可塑性的形成。在轴突的延伸、树突结构重塑及海马神经元长时程增强的形成中，RhoA都扮演重要角色。RhoA/ROCK通路参与了慢性疼痛的发展和维持。

Büyükaf?ar等［10］应用热板潜伏期和腹部收缩反射观察小鼠行为的研究发现ROCK参与了伤害感受，ROCK抑制剂Y-27632可延长热板潜伏期并减少疼痛刺激后腹部收缩发射，Western blot分析也证明了小鼠脊髓和脑组织中ROCK-2蛋白的表达。Boyce-Rustay等［11］在神经病理性疼痛、骨关节炎性疼痛和炎性疼痛以及辣椒素诱导的急性痛和继发性痛觉过敏的模型中评估了ROCK抑制剂Fasudil的镇痛作用，发现Fasudil对神经病理性疼痛和辣椒素诱导的疼痛疗效显著，对于炎性疼痛治疗效果较弱，对骨关节痛和脊髓神经结扎所导致疼痛的疗效呈剂量依赖性。

RhoA/ROCK通路通过调节一氧化氮系统参与神经病理性疼痛

一氧化氮(nitric oxide，NO)是周围和中枢神经系统伤害性感受传导中一个重要的信号分子。目前研究倾向于认为在脊髓水平低剂量和高剂量NO对伤害性感受的作用相反。鞘内注射低剂量NO供体可对糖尿病神经病理性疼痛小鼠和长春新碱诱导的神经病理性疼痛小鼠产生镇痛作用［12］，高浓度NO供体鞘内注射则降低伤害性感受阈值［13］。

Ohsawa等［9］研究了RhoA/ROCK通路在糖尿病小鼠热觉过敏中的作用。研究发现与对照组相比，链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病小鼠脊髓中与细胞膜结合的RhoA(激活状态)表达增高;鞘内注射RhoA抑制剂胞外酶C3(exoenzyme C3)及ROCK抑制剂Y-27632治疗可缓解糖尿病小鼠的热痛敏和机械痛敏;此外，腹腔注射辛伐他汀治疗也缓解了糖尿病小鼠的疼痛，表明HMG-CoA还原酶抑制剂对热痛敏的抑制主要通过RhoA/ROCK通路发挥作用。为了验证辛伐他汀对热痛敏的缓解是通过HMG-CoA还原酶途径，Ohsawa等［9］在使用辛伐他汀的同时使用HMG-CoA还原酶的产物甲羟戊酸，发现辛伐他汀对热痛敏的缓解作用被完全拮抗。进一步研究发现，糖尿病小鼠脊髓中内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和NO代谢物含量也有所下降，而辛伐他汀治疗升高了脊髓中eNOS和NO代谢物含量，证明辛伐他汀对糖尿病神经病理性疼痛的缓解作用主要是通过抑制RhoA活性从而增加eNOS和NO代谢物来实现。

RhoA/ROCK通路通过活化胶质细胞参与神经病理性疼痛

神经病理性疼痛具有神经免疫功能障碍的许多特点，胶质细胞可被伤害性刺激激活并在痛觉过敏的产生和持续中起到重要作用。激活的小胶质细胞和星形胶质细胞是中枢神经系统中炎性介质和细胞因子的一个重要来源。应用他汀类药物被证明可以在神经病理性疼痛模型中抑制机械和热痛敏的发展，并可以明显降低脊神经损伤引起的脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞活化［14］。近年来有研究表明他汀类药物主要通过抑制Rho蛋白的异戊二烯化，从而导致其功能性失活来发挥抗炎作用［15］。

Chen等［16］在福尔马林诱导的疼痛模型中研究辛伐他汀的镇痛作用机制，发现大鼠鞘内预注射辛伐他汀可明显缓解福尔马林引起的二相急性疼痛反应，连续使用7 d还可抑制福尔马林注射引起的长时程痛觉过敏。进一步研究发现脊髓小胶质细胞活化和磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶可以被辛伐他汀明显抑制。而外周福尔马林注射可引起脊髓小胶质细胞RhoA的明显活化，其活化可被辛伐他汀所抑制。

RhoA/ROCK通路通过调节单胺能系统参与神经病理性疼痛

在人类急性脑损伤的尸体解剖中发现脑部和脊髓的损伤可以分别诱导人类损伤部位表达RhoA、RhoB，在动物损伤模型中也可发现大鼠ROCKⅠ、ROCKⅡ的表达。研究表明脑部和脊髓的损伤可明显激活RhoA/ROCK通路，且这一激活可持续很长时间，使得ROCK抑制剂对损伤后急性、亚急性甚至慢性病变都有明显的治疗意义。

既往研究认为下行单胺能的系统能缓解外周伤害性感受的传导。鞘磷脂源性抑制物(myelin-associated glycoprotein and oligodendrocyte myelin glycoprotein，NogoA)通过与Nogo受体作用能妨碍轴突生长［17］，Nogo受体又可以与p75神经营养因子受体相互作用来激活小GTP酶RhoA，RhoA的激活可以引起肌动蛋白去极化和生长锥塌陷［18-19］。Ramer等［20］研究发现抑制ROCK可在增强脊神经背根切断术后轴突重塑的同时缓解冷痛敏。应用ROCK抑制剂Y-27632可加速去神经传入的脊髓背角中5-羟色胺能和酪氨酸羟化酶阳性轴突重塑，Y-27632的这种对单胺能神经轴突的作用同样能抑制脊髓背角伤害性刺激的传导。其研究发现ROCK抑制剂对脊神经背根切断术后大鼠的热痛阈和机械痛阈影响不显著，而对冷痛阈有明显提高。

RhoA/ROCK通路通过影响细胞骨架参与神经病理性疼痛

ROCKs对细胞骨架的作用主要通过磷酸化其下游LIM激酶或肌球蛋白轻链激酶而实现，可影响细胞骨架移动性、细胞形态等［21-22］。神经元的细胞骨架不仅保证细胞三维结构的稳定性，还为其对外界刺激的反应提供重要的基础结构。动态调节细胞骨架，尤其是肌动蛋白，可为细胞内蛋白的移动构建网络。这一机制可使高尔基体将新合成的蛋白质运输至胞膜［23］。而丝切蛋白(cofilin)及其上游LIM结构域蛋白激酶(LIM domain kinase，LIMK)被认为与某些蛋白从高尔基体释放并运输到胞膜相关［24］。Mittal等［25］发现当delta阿片类受体与其激动剂结合后，可通过ROCK、LIMK和b-arr1激活丝切蛋白以调节肌动蛋白的聚合作用，从而使结合delta阿片类受体从高尔基体运输至胞膜，以增强其结合delta阿片类受体的功能，而这一通路可被ROCK抑制剂所阻断。

Yoshimi等［26］发现新型高选择性ROCK抑制剂AS1892802对关节炎疼痛大鼠有镇痛作用。AS1892802对炎性和非炎性疼痛都具有镇痛作用。他们认为AS1892802的镇痛作用与其对细胞骨架的调节密切相关。

Dina等［27］研究也发现给炎性疼痛大鼠皮内注射一种肌动蛋白微丝解聚剂(latrunculin A)具有镇痛效果，提示细胞骨架在痛觉信号的传导过程中起到重要作用。Yoshimi等［26］发现AS1892802通过和微丝解聚剂(latrunculin A)相同的作用方式调节外周感觉神经末梢细胞骨架的功能。

结语与展望

综上，RhoA/ROCK信号通路在疼痛中起重要作用。近期多项研究都证明了小分子G蛋白在包括神经病理性疼痛和痛觉过敏等多种疾病状态中的活化。Qiu等［28］研究发现坐骨神经松结扎模型大鼠神经病理性疼痛与RhoA/LIMK/cofilin与通路激活相关，并且鞘内注射辛伐他汀可抑制该通路的活化，缓解神经病理性疼痛。Ohsawa等［29］认为RhoA/ROCK能引起星形胶质细胞活化，进而使豆蔻酰化富丙氨酸蛋白激酶C底物蛋白(myristoylated alanine-rich C-kinase substrate，MARCKS)磷酸化，产生神经病理性疼痛和痛觉过敏，辛伐他汀可通过抑制RhoA的活化，缓解痛觉过敏。RhoA/ROCK信号通路抑制剂在心血管、肿瘤等众多领域都有广泛应用［30-31］。因此，笔者认为抑制RhoA/ROCK信号通路在疼痛治疗中具有重要前景。

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黄宇光电话:010-69155580，E-mail:garybeijing@163．com

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2014-12-09)