桃红四物汤含药血清对缺糖缺氧损伤PC12细胞的保护作用

韩　岚，季兆洁，陈卫东，许　钒，彭代银

(安徽中医药大学药学院　安徽省现代中药重点实验室，安徽 合肥　230012)



桃红四物汤含药血清对缺糖缺氧损伤PC12细胞的保护作用

韩岚，季兆洁，陈卫东，许钒，彭代银

(安徽中医药大学药学院安徽省现代中药重点实验室，安徽 合肥230012)

[摘要]目的探讨桃红四物汤含药血清对缺糖缺氧(oxygen glucose deprivation，OGD)损伤的PC12细胞的保护作用及其机制。方法采用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)联合低糖培养基建立体外OGD致PC12细胞损伤模型；分别给予不同浓度的桃红四物汤含药血清，以MTT法检测细胞存活率，倒置显微镜观察细胞形态学变化；检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；观察Hoechst33258染色后的细胞形态学变化；Western blot法检测给药后细胞Caspase-3蛋白的表达。结果与空白血清对照组相比，经OGD损伤后，细胞活力显著降低，桃红四物汤含药血清可减轻PC12细胞形态损伤，显著提高SOD活力，降低MDA和LDH含量，降低Caspase-3蛋白表达；Hoechst 33258染色结果表明桃红四物汤含药血清能降低OGD诱导的细胞凋亡。结论桃红四物汤含药血清对OGD诱导的PC12细胞损伤具有保护作用，其机制与提高SOD活力和降低MDA含量有关。

[关键词]桃红四物汤；含药血清；缺糖缺氧；PC12细胞

缺血性脑损伤是目前严重威胁人类健康的常见病，随着中国人口老龄化的增长，缺血性脑损伤的发病率逐年增高，受到全社会的广泛关注。桃红四物汤出自于清代吴谦所著的《医宗金鉴》，由四物汤加桃仁、红花加减而成，具有养血活血、去瘀生新之功效[1-3]。现代研究证实，桃红四物汤对脑缺血动物模型具有较好的保护作用[4-6]。本实验通过建立缺糖缺氧损伤的PC12细胞模型来模拟脑缺血损伤状态下的神经细胞，观察桃红四物汤含药血清作用于细胞模型后对细胞活力及细胞形态的影响，探讨其对损伤的神经细胞的保护作用及其机制。

1材料

1.1动物及细胞株大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞株：购自中国科学院上海细胞所；SD大鼠：雄性，体质量为230～270 g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，生产许可证号为SCXK(苏)2011-0003。各组动物实验前均在实验室正常饲养1周。

1.2药材桃仁、红花、熟地黄、白芍、当归、川芎购自北京同仁堂药业有限公司，并经安徽中医药大学中药与资源教研室鉴定。桃红四物汤醇提物的制备方法[7]：各药材按复方配伍比例，加入10倍量75%的乙醇，回流提取2 h后，浓缩配制成生药含量为1.8 g/mL的提取液，4 ℃备用。

1.3药品与试剂连二亚硫酸钠(Na2S2O4)：国药集团上海化学试剂有限公司。高糖和低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)：Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)：美国Hyclone公司；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)：美国Amersco公司进口，武汉生命技术有限公司分装；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒：上海源叶科技有限公司；Hoechst 33258染色液：碧云天生物技术公司；Caspase-3抗体：北京博奥森生物技术有限公司。

1.4仪器设备洁净工作台：苏净集团安泰公司；CK2型倒置显微镜：日本Olympus公司；电子精密天平：上海精密科学仪器有限公司；CO2培养箱：日本Sanyo公司；灭菌锅：日本Tomy KOQYO公司；垂直电泳槽、转移槽、电泳仪：瑞典Amersham Biosciences公司。

2方法

2.1桃红四物汤含药血清的制备根据临床用量，按“等效剂量的直接换算法”计算出大鼠的桃红四物汤用药量。取28只雄性健康大鼠，随机分为两组，每组14只。给药组给予桃红四物汤浓缩液(1.8 g/mL)10 mL/kg。空白组给予等量生理盐水。灌胃给药，每日早晚各1次，连续3 d。末次给药1 h后，腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，腹主动脉取血，37 ℃静置1 h，3 000 r/min离心20 min，分离血清，放入离心管中，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-80 ℃保存备用。

2.2PC12细胞培养及分组给药PC12细胞接种于培养瓶中，培养基为DMEM(含10% FBS、青霉素100 kU/L和链霉素100 kU/L)，置于37 ℃、5% CO2培养箱，相对饱和湿度的条件下培养。细胞呈单纯贴壁生长，隔日换液，待细胞长至80%～90%的密度，用胰酶/乙二胺四乙酸钠消化传代，每2～3 d传代1次。取对数生长期的细胞，经消化、离心、完全培养基重悬后，接种于96孔培养板，细胞密度为1×105/mL，按每孔100 μL接种在96孔培养板内，培养24 h后，按以下分组进行实验。空白血清对照组：高糖DMEM+空白大鼠血清(浓度分别为5%、10%、15%)；缺糖缺氧(oxygen glucose deprivation，OGD)损伤组：低糖DMEM+Na2S2O4(终浓度20 mmol/L)+空白大鼠血清(浓度分别为5%、10%、15%)；桃红四物汤含药血清组：低糖DMEM+Na2S2O4(终浓度20 mmol/L)+桃红四物汤含药血清(浓度分别为5%、10%、15%)。培养24 h后进行各项指标检测。

2.3MTT法测定细胞活力取对数生长期的PC12细胞按4×104/mL密度，接种至96孔培养板中，培养箱中培养过夜，分组进行处理，每组设6个复孔。培养结束后，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL反应4 h后，吸去上清液，以150 μL二甲基亚砜溶解蓝紫色颗粒，于10 min内在全自动酶标仪上室温避光振荡混匀并于490 nn波长测定各孔的吸光度值。

2.4LDH释放、MDA含量及SOD活性的测定PC12细胞接种于培养瓶，按实验分组给药后，取细胞培养上清液进行LDH检测。胰酶消化收集细胞，超声打碎后根据SOD、MDA试剂盒说明书操作，在450 nm波长下用多功能酶标仪检测每孔光密度(optical density，OD)值。分别计算各组LDH、SOD活性和MDA含量。

2.5细胞形态学观察及Hoechst 33258染色将PC12细胞胰酶消化，重悬后接种于6孔板，给药后培养24 h，药物作用结束后置于倒置显微镜下观察、拍照。按文献[8]的方法，分别将各组细胞吸除原有培养基，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤2遍，加入250 μL预冷的4%多聚甲醛，室温固定细胞20 min后，去除固定液，再用PBS洗涤3次，吸去液体；每孔加入终浓度为2 μg/mL的Hochest 33258染色液(PBS稀释)，置于摇床室温下避光染色5 min；去除染色液，再置于摇床上用PBS洗2次，置荧光显微镜下观察并拍照。

2.6Western blot检测细胞Caspase-3蛋白的表达模型复制及药物处理后，收集细胞，加入150 μL细胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min离心30 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。样品与1/4倍量5×SDS上样缓冲液混合均匀，煮沸使其变性，经12% SDS-PAGE凝胶电泳分离，200 mA恒流2 h转印至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭3 h后，加入Caspase-3抗体(1∶1 000)封闭过夜。第2天PBST洗涤3次，每次10 min，二抗室温孵育2 h。PBST洗膜3次，与化学发光试剂盒ECL反应，X线胶片曝光显影。

3结果

3.1桃红四物汤含药血清对OGD诱导PC12损伤后细胞活力的影响两因素析因设计的方差分析表明，分组因素和浓度因素对PC12细胞存活率的主效应及其交互作用均具有统计学意义(P<0.05)。在相同血清浓度下，OGD损伤组PC12细胞存活率均显著低于空白血清对照组(P<0.05)，桃红四物汤含药血清组PC12细胞存活率均显著高于OGD损伤组(P<0.05)。在分组相同时，PC12细胞存活率随血清浓度升高而升高，其中15%血清组均显著高于10%血清组(P<0.05)。见图1。

注：与5%空白血清组比较，aP<0.05；与10%空白血清对照组比较，bP<0.05；与同浓度空白血清对照组比较，*P<0.05；与同浓度OGD损伤组比较，#P<0.05。

图1不同浓度桃红四物汤含药血清对OGD损伤的

与相同血清浓度的OGD损伤组相比，桃红四物汤5%、10%含药血清组能显著降低LDH活性(P<0.05)，10%、15%含药血清组能显著降低MDA含量(P<0.05)，10%、15%含药血清组能显著提高SOD活性(P<0.05)。见表1。

血清浓度/%组别nLDH/(U/L)MDA/(μmol/L)SOD/(U/mL)5空白血清对照6975.82±92.789.52±0.2716.55±0.77OGD损伤61333.47±179.56*16.00±0.65*11.89±1.27*桃红四物汤含药血清61097.93±118.67#14.96±1.1012.72±0.9810空白血清对照6914.28±52.868.55±0.7818.71±0.96OGD损伤61259.16±147.21*15.46±1.32*13.43±0.81*桃红四物汤含药血清61042.95±128.35#12.81±1.64#16.42±0.50#15空白血清对照6668.72±45.476.46±0.7519.78±1.35OGD损伤6901.49±44.88*12.05±1.61*16.23±0.93*桃红四物汤含药血清6815.11±86.269.49±1.26#18.65±0.82#

注：与同浓度空白血清对照组比较，*P<0.05；与同浓度OGD损伤组比较，#P<0.05。

3.2桃红四物汤含药血清对OGD损伤的PC12细胞形态的影响倒置显微镜下观察，空白血清对照组细胞形态正常，呈梭形或多角形，折光性好，数量多，突起较长。OGD损伤组细胞回缩变圆，折光性下降，突起变短。而10%桃红四物汤含药血清组细胞损伤明显减轻，细胞结构基本完整。见图2。

注:A.10%空白血清对照组;B.10%空白血清+OGD损伤组;C.10%桃红四物汤含药血清+OGD损伤组。

图2桃红四物汤含药血清对OGD损伤的

PC12细胞形态的影响(10×10倍)

3.3桃红四物汤含药血清抑制OGD损伤PC12细胞凋亡的作用空白血清对照组PC12细胞核在Hoechst 22358染色下呈均一黯淡的蓝色荧光，细胞核较规则，OGD损伤处理后多数细胞核呈较强蓝白色的荧光，而桃红四物汤含药血清处理后，核固缩情况缓解，荧光形态基本恢复正常，细胞核较少出现蓝白色荧光。见图3。

3.4桃红四物汤含药血清对OGD损伤的PC12细胞中Caspase-3蛋白表达的影响与空白血清对照组相比，OGD损伤组Caspase-3蛋白表达明显增加(P<0.05)；与OGD损伤组相比，10%桃红四物汤含药血清能够明显降低Caspase-3的蛋白表达(P<0.05)。见图4。

注:A.10%空白血清对照组;B.10%空白血清+OGD损伤组;C.10%桃红四物汤含药血清+OGD损伤组。

图3桃红四物汤含药血清对OGD损伤PC12细胞

凋亡的作用(Hoechst 33258染色法，10×40倍)

注：1. 10%空白血清对照组；2. 10%空白血清+OGD损伤组；3. 10%桃红四物汤含药血清+OGD损伤组；与10%空白血清对照组比较*P<0.05；与10%空白血清+OGD损伤组比较，#P<0.05。

图4桃红四物汤含药血清对OGD损伤的PC12细胞中

Caspase-3表达的影响(n=3)

4讨论

本实验采用PC12细胞作为体外研究对象。PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞，广泛用于神经药理学研究。Na2S2O4是一种氧清除剂，能够迅速清除培养基中的氧，而不损伤细胞膜。本研究采用Na2S2O4联合低糖培养基复制的OGD损伤模型，较好地模拟了在体缺糖缺氧对神经细胞造成的损伤，并用桃红四物汤含药血清干预此细胞，研究其保护作用及作用机制。桃红四物汤为去瘀生新、活血养血的经典方。现代药理学研究发现，其具有抗氧化[9]、防治缺血性卒中[10]等作用。桃红四物汤中含有多种活性成分，如阿魏酸[11]、川芎嗪[12]、藁本内酯[13]、羟基红花黄色素A[14]等，均在神经保护方面具有显著优势。

本实验通过前期MTT法筛选，采用20 mmol/L的Na2S2O4联合低糖培养基作用细胞24 h后，细胞活力显著降低；而桃红四物汤含药血清预处理后细胞活力显著上升。LDH是反映细胞膜完整性和细胞损伤程度的一种简便且灵敏的指标。脑组织在缺血缺氧状态下，受损细胞会释放出LDH，并经受损的血脑屏障进入血液循环[15]。实验结果表明，5%、10%的桃红四物汤含药血清能明显减少LDH的释放，减少细胞的死亡率。

氧化应激损伤是造成脑缺血损伤的主要因素之一，主要表现为血中抗氧化物的含量迅速减少[16]。SOD是体内天然存在的自由基清除酶，能清除超氧阴离子，对抗氧化平衡起着至关重要的作用[17]。MDA是脂质过氧化的产物，其产生量与氧自由基量呈正相关，可反映氧自由基水平，间接反映出细胞损伤程度[18]。本研究结果表明，OGD损伤可导致PC12细胞SOD活性降低，MDA含量增加；而10%、15%的桃红四物汤含药血清能显著降低MDA含量，提高SOD活性。

细胞凋亡与脑缺血损伤关系密切，且在缺血的发生、发展过程中发挥着重要作用，早期进行抗凋亡治疗对抗脑缺血损伤具有重要的意义[19]。Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键性执行分子，降低Caspase-3的活性能够有效抑制凋亡的发生发展。已有文献报道OGD损伤能够激活Caspase-3蛋白的表达[20]，本实验证实10%的含药血清对损伤的PC12细胞保护作用最为明显，倒置显微镜下观察，细胞形态接近正常；Hoechst染色结果表明细胞凋亡数减少；Western blot结果显示，10%含药血清能够抑制OGD诱导的促凋亡蛋白Caspase-3表达的上调。这些结果表明，桃红四物汤能够对抗脑缺血引起的神经细胞凋亡，具有神经保护作用。

本实验从细胞水平验证了桃红四物汤含药血清对OGD处理的PC12细胞具有显著的保护作用，其机制可能与抗氧化应激反应，下调Caspase-3蛋白抗凋亡相关。然而脑缺血损伤机制较为复杂，桃红四物汤能否作为一种脑保护药物仍需进一步通过相关实验进行探讨。

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Protective Effect of Serum Containing Taohong Siwu Decoction on PC12 Cells against Oxygen-Glucose Deprivation

HANLan,JIZhao-jie,CHENWei-dong,XUFan,PENGDai-yin

(AnhuiKeyLaboratoryforModernChineseMateriaMedica,SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the protective effect of serum containing Taohong Siwu Decoction (S-TSD) on PC12 cells against oxygen-glucose deprivation (OGD) and the related mechanism. MethodsSodium dithionite (Na2S2O4)+DMEM (low glucose) was applied to establish the model ofinvitroOGD injury in PC12 cells, and the cells were treated with different concentrations of S-TSD. MTT assay was applied to measure the cell viability, and inverted microscopy was applied to observe the changes in cell morphology; the activities of lactate dehydrogenase (LDH) and superoxide dismutase (SOD) were measured, and the content of malondialdehyde (MDA) was determined. The changes in cell morphology after Hoechst 33258 staining were observed; Western blot was used to measure the protein expression of Caspase-3 after administration. ResultsCompared with the blank control group, the cell viability decreased significantly after OGD injury, while S-TSD reduced the morphological injury of PC12 cells, significantly increased the activity of SOD, reduced the content of MDA and LDH, and reduced the protein expression of Caspase-3. The results of Hoechst 33258 staining showed that S-TSD reduced cell apoptosis induced by OGD.ConclusionS-TSD can protect PC12 cells against the injury induced by OGD, and its mechanism is related to the increase in the activity of SOD and the reduction in the content of MDA.

[Key words]Serum containing Taohong Siwu Decoction; Oxygen-glucose deprivation; PC12 cell

收稿日期：(2015-01-08；编辑：曹健)

通信作者：彭代银，pengdy@ahtcm.edu.cn

作者简介：韩岚(1982-)，女，博士研究生

基金项目：国家自然科学基金项目(81473387)；安徽省自然科学基金项目(1408085QH163)；安徽省高等学校自然科学优秀青年基金课题(81073091)

[中图分类号]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.01.020