芪玉三龙汤对肺癌移植瘤小鼠PI3K/Akt/mTOR通路PI3K、Akt、mTOR表达的影响

张星星，童佳兵，杨　程，王传博，李泽庚

(1.湖北中医药大学，湖北 武汉　430065；2.国家中医药管理局重点学科安徽中医药大学中医肺病学科，

安徽 合肥　230031；3.安徽省中医药科学院中医呼吸病防治研究所，安徽 合肥　230038)



芪玉三龙汤对肺癌移植瘤小鼠PI3K/Akt/mTOR通路PI3K、Akt、mTOR表达的影响

张星星1,2,3，童佳兵2,3，杨程2,3，王传博2,3，李泽庚2,3

(1.湖北中医药大学，湖北 武汉430065；2.国家中医药管理局重点学科安徽中医药大学中医肺病学科，

安徽 合肥230031；3.安徽省中医药科学院中医呼吸病防治研究所，安徽 合肥230038)

[摘要]目的研究芪玉三龙汤对小鼠皮下移植瘤生长及对PI3K/Akt/mTOR信号通路调节的影响。方法采用Lewis肺癌细胞培养移植法复制肺癌荷瘤小鼠模型，荷瘤成功后随机分为模型组，化学治疗组，芪玉三龙汤高、中、低剂量组，联合组；观察小鼠的生存状态，绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率；Western blot法检测荷瘤小鼠肿瘤组织PI3K、Akt、mTOR蛋白表达。结果芪玉三龙汤高剂量组、联合组生存状态优于化学治疗组；芪玉三龙汤对肺肿瘤具有温和的抑制作用，其高剂量抑制肿瘤生长作用较优，但量效关系不明显，其与顺铂联用无明显增效作用；芪玉三龙汤可以下调PI3K、Akt和mTOR表达水平，和顺铂联用对下调关键分子Akt的表达具有明显的协同作用。结论芪玉三龙汤对肺癌移植瘤的抑制作用可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路关键分子有关，与化学治疗药联用可协同下调关键蛋白Akt的表达。

[关键词]芪玉三龙汤；肺癌；PI3K；Akt；mTOR；信号通路

原发性支气管肺癌简称肺癌，是呼吸系统最常见恶性肿瘤。肿瘤登记中心2014年发布的资料显示，中国肺癌发病率及病死率居所有恶性肿瘤之首，且呈逐年上升趋势。以非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)最常见，约占所有肺癌的85%[1]。虽然NSCLC的治疗手段取得了一定的进展，但其整体预后仍然很差，5年生存率不足15%[2]。中医药治疗肺癌具有一定优势，能够减少放射治疗和化学治疗后的毒性和不良反应，改善患者的生存状态。芪玉三龙汤处方来源于长期临床实践，在国家级名老中医韩明向教授临床经验方基础上，由安徽中医药大学李泽庚教授研究团队多次优化处方而成。为证实芪玉三龙汤对肺癌的治疗作用，探讨其作用机制，笔者采取Lewis肺癌细胞建立皮下移植瘤小鼠模型，研究芪玉三龙汤对荷瘤小鼠的抑瘤作用，并从调节PI3K/Akt/mTOR信号通路的角度对芪玉三龙汤的抗肿瘤机制进行初步探讨，为临床运用芪玉三龙汤治疗肺癌提供实验依据。

1材料

1.1实验药物芪玉三龙汤由黄芪、玉竹、天龙、地龙、龙葵、白花蛇舌草、薏苡仁、泽漆、莪术、川贝母组成，由安徽中医药大学第一附属医院中药房提供，常规水煎，水浴浓缩至生药含量为4.024 g/mL，4 ℃冰箱保存备用。注射用顺铂，由齐鲁制药有限公司生产，批准文号为国药准字H37021357，每瓶20 mg，由安徽中医药大学第一附属医院西药房提供，用生理盐水稀释至0.367 mg/mL。

1.2实验动物近交系C57BL/6小鼠，48只，鼠龄6～8周，雄性，体质量(20±2)g，动物级别SPF级，购自江苏省常州卡文斯实验动物有限公司，生产许可证号为SCXK(苏)2011-0003，饲养于安徽中医药大学教育部重点实验室动物房，室温25 ℃，湿度70%，国家标准固体混合饲料喂养，小鼠自由采食和饮水。

1.3瘤株小鼠Lewis肺癌细胞株，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，培养于高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中静置培养。

1.4主要实验试剂和仪器高糖DMEM：批号 NAA1321，美国 HyClone公司；兔抗鼠PI3K多克隆抗体(批号 CJ44121)、兔抗鼠Akt多克隆抗体(批号 CJ51250)、兔抗鼠mTOR多克隆抗体(批号CJ44121)：均购自美国Bioworld公司；辣根过氧化物酶标记的二抗(批号112971)：北京中杉公司；MCO-175 CO2细胞培养箱：日本Sanyo公司；CKX41倒置显微镜：日本OLYMPUS公司；SW-CJ-IF超净工作台：江苏苏净集团安泰公司；EPS300型电泳仪、VE-186型转膜仪：上海天能科技有限公司。

2方法

2.1模型复制取对数生长期Lewis肺癌细胞，胰酶消化后离心收集细胞，1 800 r/min离心5 min，用无血清的高糖DMEM重悬洗涤并调整细胞浓度为1×107/mL，用1 mL注射器吸取细胞悬液0.2 mL(含细胞数2×106)注射于C57BL/6小鼠左侧腋部皮下，建立小鼠皮下移植瘤动物模型。

2.2分组与给药接种10 d后，检测小鼠成瘤状况，将符合要求的成瘤小鼠随机分为模型组，化学治疗组，芪玉三龙汤高、中、低剂量组，联合组(芪玉三龙汤+顺铂)，每组8只。各组均在接种10 d后给药。①模型组：0.02 mL/g生理盐水灌胃10 d，并分别在第1、3、5天腹腔注射生理盐水0.4 mL，下同。②化学治疗组：0.02 mL/g生理盐水灌胃10 d，并分别在第1、3、5天腹腔注射顺铂溶液0.4 mL(含有顺铂0.146 8 mg)。③芪玉三龙汤高剂量组：80.48 g/kg(相当于临床成人日用量的4倍)芪玉三龙汤灌胃10 d，并分别在第1、3、5天腹腔注射生理盐水0.4 mL。④芪玉三龙汤中剂量组：40.24 g/kg(相当于临床成人日用量的2倍)芪玉三龙汤灌胃10 d，并分别在第1、3、5天腹腔注射生理盐水0.4 mL。⑤芪玉三龙汤低剂量组：20.12 g/kg(相当于临床成人日用量的1倍)芪玉三龙汤灌胃10 d，并分别在第1、3、5天腹腔注射生理盐水0.4 mL。⑥联合组：80.48 g/kg(以芪玉三龙汤高剂量为联合给药剂量)芪玉三龙汤药液灌胃10 d，并分别在第1、3、5天腹腔注射顺铂溶液0.4 mL。

2.3观察指标

2.3.1生存状态观察各组小鼠进食、精神状态、活动状态、消瘦程度、褪毛及死亡情况等。

2.3.2肿瘤生长曲线的绘制分别于第1、5、8、10天用游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤的长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积。计算公式为V=ab2/2，绘制肿瘤生长曲线。实验结束后以肿瘤体积为纵坐标，给药天数为横坐标绘制肿瘤生长曲线。

2.3.3抑瘤率给药第11天处死小鼠，完整剥取腋部皮下肿瘤组织，精密电子天平称质量，分别计算各组抑瘤率，抑瘤率=(模型组平均肿瘤质量-给药组平均肿瘤质量)/模型组平均肿瘤质量×100%。

2.4Western Blot法检测荷瘤小鼠肿瘤组织PI3K、Akt、mTOR蛋白表达采用Western Blot法检测荷瘤小鼠肿瘤组织中蛋白的表达。提取各组小鼠肿瘤组织总蛋白样品，经SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白组分后，将蛋白转印于PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入不同浓度的一抗(PI3K为1∶1 000，Akt为1∶500，mTOR为1∶500)，4 ℃孵育过夜，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000稀释)，室温封闭2 h，电化学发光法显色后胶片曝光并分析结果。

3结果

3.1各组小鼠生存状态观察模型复制10 d后，小鼠成瘤率为100%。模型复制后给药第5天时，化学治疗组小鼠进食及精神状态最差，活动度开始下降，毛色无光，之后活动度持续下降，喜好扎堆，毛色渐渐干枯无光，呈缕状，褪毛严重，反应迟钝，倦卧懒动，极度消瘦。模型组小鼠第8天开始活动度有所下降，有扎堆现象，精神状态一般，毛色暗淡无光，进食尚佳。芪玉三龙汤高、中、低剂量组小鼠进食一直尚好，精神状态明显优于化学治疗组，消瘦不明显，有轻微褪毛现象，其中以高剂量组小鼠的生存状态最好。联合组小鼠的生存状态较芪玉三龙汤组欠佳，但明显优于化学治疗组，说明芪玉三龙汤有改善化学治疗小鼠生存状态的作用。各组小鼠在取材前均未死亡。

3.2对荷瘤小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用

3.2.1肿瘤生长曲线从肿瘤生长曲线可以直观地看出，芪玉三龙汤高、中、低剂量组和模型组的肿瘤生长曲线高度重叠，化学治疗组和联合组的生长曲线高度重合。见图1。

3.2.2芪玉三龙汤对肿瘤生长抑制作用的量效关系考察以模型组，芪玉三龙汤低、中、高剂量组为实验组合进行单因素方差分析，结果显示，4组的肿瘤体积和肿瘤质量比较，差异无统计学意义(肿瘤体积：F(3，28)=0.537，P=0.230；肿瘤质量：F(3，28)=2.268，P=1.954)，以芪玉三龙汤高剂量组的抑瘤率为最高。见表1。

3.2.3芪玉三龙汤和化学治疗药的交互作用以模型组、化学治疗组、芪玉三龙汤高剂量组、联合组为实验组合进行两因素析因设计的方差分析，结果提示，化学治疗药对肿瘤体积和肿瘤质量的主效应具有统计学意义(P<0.05)，芪玉三龙汤对肿瘤体积和肿瘤质量的主效应无统计学意义(P>0.05)，两者的交互作用也无统计学意义(P>0.05)。联合组和化学治疗组的抑瘤率相当。见表2。结果提示，芪玉三龙汤对肺肿瘤具有温和的抑制作用，其高剂量抑制肿瘤生长的作用较优，但量效关系不明显，尚不能认为其与顺铂联用有明显的增效作用。

3.3对各组荷瘤小鼠肿瘤组织PI3K、Akt、mTOR蛋白表达的影响

±s)

组 别n芪玉三龙汤顺铂肿瘤体积/cm3肿瘤质量/g抑瘤率/%模 型8不用不用4.32±1.545.45±0.940芪玉三龙汤低剂量84.21±1.974.82±1.4711.64芪玉三龙汤中剂量84.06±1.354.73±0.7113.17芪玉三龙汤高剂量8不用用3.72±1.124.15±1.05*23.86化学治疗8用不用0.39±0.15*1.53±0.72*71.87联 合8用用0.39±0.27#1.53±0.77#71.90

注：与模型组比较，*P<0.05；与芪玉三龙汤高剂量组比较，#P<0.05。

表2　芪玉三龙汤和顺铂联用对肿瘤生长抑制作用的两因素析因设计的方差分析结果

3.3.1芪玉三龙汤的量效关系考察以模型组，芪玉三龙汤低、中、高剂量组为实验组合进行单因素方差分析，结果显示，4组PI3K、Akt和mTOR相对表达水平的差异均具有统计学意义(PI3K：F(3，28)=45.667，P=0.000；Akt：F(3，28)=223.596，P=0.000；mTOR：F(3，28)=1 132.479，P=0.000)，以芪玉三龙汤高剂量组PI3K、Akt和mTOR的相对表达水平为最低。结果见表3、图2。

3.3.2芪玉三龙汤和顺铂的交互作用考察以模型组、芪玉三龙汤高剂量组、化学治疗组和联合组为实验组合进行两因素析因设计的方差分析，结果显示，化学治疗药顺铂对Akt和mTOR表达水平的主效应具有统计学意义(P<0.05)，对PI3K表达水平的主效应无统计学意义(P>0.05)，芪玉三龙汤对PI3K、Akt和mTOR表达水平的主效应均具有统计学意义(P<0.05)，芪玉三龙汤和顺铂对PI3K、Akt和mTOR表达水平的交互作用均具有统计学意义(P<0.05)。见表4和图2。结果提示，芪玉三龙汤和顺铂对下调Akt的表达具有明显的协同作用，对下调PI3K和mTOR的表达无明显协同作用。

±s)

注：与模型组比较，*P<0.05；与芪玉三龙汤低剂量组比较，#P<0.05；与芪玉三龙汤中剂量组比较，△P<0.05；与芪玉三龙汤高剂量组比较，□P<0.05；与化学治疗组比较，◇P<0.05。

表4　芪玉三龙汤和顺铂联用对PI3K、Akt、mTOR影响的两因素析因设计的方差分析结果

注：1.模型组；2.化学治疗组；3.联合组；4.芪玉三龙汤低剂量组；5.芪玉三龙汤中剂量组；6.芪玉三龙汤高剂量组。

图2各组肿瘤组织PI3K、Akt和mTOR蛋白表达水平比较(Western blot法)

4讨论

肺癌属于中医学的“肺积”“息贲”“咳嗽”等范畴[3]。现多认为其发生是在脏腑正气亏虚的基础上，外感六淫邪毒，内伤饮食情志，肺之功能失常，导致气滞、血瘀、痰凝、毒聚等病理因素作用于肺，日久形成肺部有形积块。芪玉三龙汤由黄芪、玉竹、天龙、地龙、龙葵、白花蛇舌草、薏苡仁、泽漆、莪术、川贝母组成。方中黄芪补肺益气，龙葵解毒抗癌，共为君药；天龙、地龙、泽漆解毒消积、活血散结，与黄芪相须为臣；白花蛇舌草清热解毒、活血化瘀，莪术破血行气、消积止痛，薏苡仁补益肺脾，玉竹养阴生津，共为佐药，川贝母化痰润肺、消肿散结为使。肺癌发病本质乃本虚标实，肺气虚损为本，血瘀、痰凝、毒聚为标。以上诸药合用，共奏益气养阴、化痰祛瘀、解毒消积之功。

PI3K/Akt/mTOR通路是目前研究肿瘤发生发展的热点，而且在肺癌组织中活化表达并成为肺癌治疗的靶点之一[4]。PI3K作为该通路的起始因子，可被多种生长因子激活，如表皮生长因子受体[5]、血管内皮生长因子[6]和人类表皮生长因子受体2[7]，这些因子的突变可以引起该通路的激活而调节多种细胞的生命活动，包括细胞生存、增殖和分化[8]。其过程主要是上述各种生长因子作用于膜受体而使PI3K激活，然后在质膜上产生第二信使PIP3，PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt和PDK1结合，促使PDK1磷酸化Akt蛋白的Thr308位点，促使Akt活化，Akt还可通过PDK2对其Ser473位点的磷酸化而导致其活化[9-10]。Akt是PI3K/Akt信号通路的关键分子，PI3K激活的Akt可以磷酸化激活其下游多种靶蛋白如mTOR，从而诱导细胞生长，促进细胞存活，是重要的抗凋亡调节因子[11]。抑制该通路的活化可以促进肺癌细胞凋亡[12]，有研究证明中药亦可调控PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而有效抑制肺癌细胞的生长[13]。

本研究通过药物干预肺癌皮下移植瘤模型，观察各组动物的生存状态、移植瘤的生长情况、抑瘤率，芪玉三龙汤组生存状态良好，化学治疗组毒性和不良反应最大，但是联合组有改善化学治疗小鼠的生存状态的作用。而且芪玉三龙汤对肺肿瘤具有温和的抑制作用，其高剂量抑制肿瘤生长作用较优，但量效关系不明显，其与顺铂联用无明显增效作用，但从调控蛋白角度而言，芪玉三龙汤可以下调PI3K、Akt和mTOR表达水平，和顺铂联用对下调关键分子Akt的表达具有明显的协同作用。本次研究表明，芪玉三龙汤可以改善肺癌化学治疗小鼠的生存状态，对肿瘤生长有一定抑制作用，能够下调PI3K/Akt/mTOR信号通路中关键蛋白的表达，此次实验取得了一些初步成果，为进一步研究奠定基础，下一步应扩大样本量，寻找最佳设计方案，深入研究芪玉三龙汤干预肺癌的疗效及其相关机制。

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Effect of Qiyu Sanlong Decoction on Expression of PI3K, Akt, and mTOR in PI3K/Akt/mTOR Signaling Pathway in Mouse Model of Lung Cancer Xenograft

ZHANGXing-xing1,2,3,TONGJia-bing2,3,YANGCheng2,3,WANGChuan-bo2,3,LIZe-geng2,3

(1.HubeiUniversityofChineseMedicine,HubeiWuhan430065,China; 2.NationalKeyDisciplinesofLungofAnhuiUniversityofChineseMedicine,StateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China; 3.InstituteforPreventionandTreatmentofRespiratoryDiseases,InstituteforPreventionandTreatmentofRespiratoryDiseases,AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of Qiyu Sanlong (QYSL) Decoction on the growth of subcutaneous xenograft and regulation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in mice bearing lung cancer. MethodsThe mouse model of lung cancer xenograft was established using Lewis lung carcinoma (LLC) cells. After the successful establishment of the model, the mice were randomly divided into model group, chemotherapy group, high-, medium-, and low-dose QYSL Decoction groups, and combination group. Survival was observed in each group, the curve for tumor growth was plotted, and the tumor inhibition rate was calculated; Western blot was applied to measure the protein expression of phosphoinositide 3-kinase (PI3K), Akt, and mammalian target of rapamycin (mTOR) in tumor tissue. ResultsThe high-dose QYSL Decoction group and the combination group had a better survival compared with the chemotherapy group; QYSL Decoction mildly inhibited lung tumor, and high-dose QYSL Decoction had a better inhibitory effect on tumor growth compared with other doses of QYSL Decoction, but without significant dose-effect relationship, and its combination with cisplatin had no significant synergistic effect; QYSL Decoction downregulated the protein expression of PI3K, Akt, and mTOR, and its combination with cisplatin had a significant synergistic effect in the downregulation of the key molecule Akt. ConclusionThe inhibitory effect of QYSL Decoction on lung cancer xenograft may be related to the regulation of key molecules in the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway, and a combination of QYSL Decoction and chemotherapeutic agents has a synergistic effect in the downregulation of the key protein Akt.

[Key words]Qiyu Sanlong Decoction; Lung cancer; Phosphoinositide 3-kinase; Akt; Mammalian target of rapamycin; Signaling pathway

收稿日期：(2015-06-24；编辑：曹健)

通信作者：李泽庚，li6609@126.com

作者简介：张星星(1985-)，女，博士研究生

[中图分类号]R734.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.01.022