QF-PCR快速产前诊断常见非整倍体病的价值

纪妍，朱津，卢燕

(惠州市中心人民医院产前诊断中心，广东惠州516001)

QF-PCR快速产前诊断常见非整倍体病的价值

纪妍，朱津，卢燕

(惠州市中心人民医院产前诊断中心，广东惠州516001)

目的评价荧光定量聚合酶链反应(OF-PCR)技术在产前快速诊断常见染色体非整倍体病的临床价值。方法选取2013年1月至2014年6月在我院进行产前诊断的孕妇1 035例，所有孕妇均接受染色体核型分析及QF-PCR检查，比较并分析两种检验结果的符合性。结果染色体核型分析正常的孕妇1 008例中有4例QF-PCR怀疑异常，其中3例经增加短串联重复序列(STR)位点再次分析，结果正常，1例随访未见异常。18例21、18、13、X、Y染色体非整倍体两者结果一致(包括1例18三体嵌合体及1例易位型21-三体)，符合率为100%。结论QF-PCR能快速高效的检出染色体非整倍体，但仍有误诊可能，选择适宜的STR组合可以提高检测效率，QF-PCR作为染色体核型分析的有效补充在快速产前诊断中有重要价值。

荧光定量聚合酶链反应；非整倍体；产前诊断；短串联重复序列

随着优生优育知识的宣传普及，孕妇对产前诊断的接受度逐渐提高，而产前诊断染色体异常的传统方法为核型分析，分析结果报告时间一般在2～4周，孕妇及其家庭在等待结果过程中压力巨大[1]，因此如能采取快速价廉而相对准确的技术获取早期初步结果很有必要。荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)可利用间期细胞进行分析，克服了核型分析周期长的缺点，但技术复杂，操作步骤繁琐，试剂昂贵，因此不适合临床大规模开展[2]。而荧光定量聚合酶链反应(Quantitative fluorescent polymerase chain reaction，QF-PCR)技术利用荧光引物对染色体上特异的STR位点进行扩增，通过仪器对荧光变量的检测实现对染色体数目的判断。该检测具有出结果快，准确性高，检测批量大，试剂成本低廉的优点，对产前诊断中常见且后果严重的染色体非整倍体病变有较好的预判价值。本文回顾性分析我院产前诊断中心近年来同时接受染色体核型分析及QF-PCR两种方法进行羊水或脐血产前诊断染色体病的孕妇1 035例，分析两种报告的发放时间及结果的符合性，探讨QF-PCR对染色体非整倍体病的产前诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料2013年1月至2014年6月在我院产前诊断中心接受产前诊断并正常报告结果(同时行染色体核型分析及QF-PCR检测)的孕妇1 035例，标本类型为羊水或脐血。

1.2 方法

1.2.1 羊水脐血细胞培养及染色体核型分析采用相应培养基培养细胞，获得足量分裂细胞，然后加入秋水仙素使分裂的细胞处于分裂中期，染色后，置于显微镜下观察进行核型分析。

1.2.2 羊水及脐血QF-PCR取1～2 ml羊水或1 ml脐血采用TaKaRa公司的基因组提取试剂盒提取DNA，所提取的DNA均采用紫外分光光度仪测OD280及OD260值以确保适宜的浓度和纯度。采用达安基因公司检测试剂盒：21-三体/性染色体多倍体检测试剂盒及18-三体/13-三体多倍体检测试剂盒。检测所用STR位点、位置等详见表1，部分标本怀疑母血污染，抽取母血检测其DNA中STR位点，加以排除。按照试剂盒条件对每个标本分A(21及X/Y染色体)B (18/13染色体)两个体系进行扩增；甲酰胺9.0 μl与内标GeneScan Rox-500 size standard(ABI)0.3 μl混合，加入A扩增体系PCR产物1.0 μl或B扩增体系PCR产物1.5 μl，混匀，借助于ABI3100测序仪进行基因片段扫描分析，PCR产物1 μl与离子酰胺13.5 μl，Genescan-500 0.5 μl混合，95℃变性5 min，后冰浴，将产物放置于ABI3100遗传分析仪进行电泳。CENESCAN基因分型软件扫描分析凝胶上扩增产物及内标的位置，确定产物片段的大小。对怀疑母血污染的标本同时采集母体标本行QF-PCR进行对照，避免母血污染对结果的错误评判。

1.2.3 QF-PCR非整倍体的判断标准根据国际公认的判断标准(ACC/CMGS)，正常双峰面积比值(高峰面积/低峰面积)区间：0.8～1.4，凡双峰面积比值＞1.8或者＜0.65时可判断为三体，一个样本出现两个有意义位点方可明确诊断[3]。

1.3 统计学方法采用SPSS10.0分析软件进行描述性统计分析。

2 结果

2.1 两种方法检测结果比较1 035例标本中包含脐血15例，羊水1 020例。染色体核型分析显示正常1 008例，其中1 004例QF-PCR也显示正常，另有4例QF-PCR分别显示21单体、不排除部分单体及不排除为X单体、三体或二倍体；染色体核型分析检出10例21-三体(包括1例异位型)，3例18三体(包括一例嵌合体)，5例性染色体数目异常，QF-PCR均检出，无漏诊；此外研究对象中染色体核型分析还发现有9例染色体结构异常，QF-PCR未能检出。两检测技术结果比较见表2。

表2 染色体核型与QF-PCR检测结果分析

2.221 号染色体上3个STR位点检测率分析染色体核型分析显示有21-三体10例(包括1例异位型)，QF-PCR均检出，无漏诊。其余1 025例中一例QF-PCR提示为21单体，但染色体核型显示正常，将标本送外院增加21号STR位点再次检测，显示为正常。还有一例两次检测均示D21S1411未显示，不能排除部分单体，染色体核型及彩超未见异常。孕妇拒绝进一步检查，胎儿娩出后随访半年未见异常。QF-PCR 21号染色体上的特异性STR位点，结果与染色体核型的吻合情况见表3。

表321 号染色体上3个STR位点检测率分析[例(%)]

2.318 号染色体上4个STR位点检测率分析染色体核型分析检出3例18-三体[包括一例嵌合体47XY，+18(45/50)；46XY(5/50)]，QF-PCR均检出，无漏诊。其余1 032例在18号染色体上QF-PCR结果与染色体核型分析完全相符。3例18-三体STR位点显示情况见表4。

2.413 号染色体及性染色体STR位点检测情况此次检查未发现有13三体及单体，1 035例样本中染色体分析发现有3例45，XO；1例47，XXY及1例47，XYY；QF-PCR结果均与之相符。有2例染色体核型未见异常，QF-PCR提示不排除为X单体、三体或二倍体，后增加X染色体位点DXS6809再次检测，证实为二倍体。

表43 例18-三体STR位点情况分析

3 讨论

众所周知，21-三体、18-三体、13-三体以及性染色体数目异常是最常见的染色体非整倍体病变[4]，这类患者往往有智力低下或生育功能受损，因此早期诊断、及时干预以避免该类患儿出生对提高人口质量，改善家庭生活水平意义重大。

随着唐氏筛查的普及，高龄孕妇的增加，群众对于产前诊断认知度的提高，越来越多的孕妇愿意接受产前诊断。但是常规染色体核型分析存在着耗时长、工作量大、易污染、失败率高等缺点。因此选用适宜的方法作为替代或补充是有必要的[5]。目前已成功应用于临床的快速产前诊断手段有FISH、QF-PCR、多重连接探针扩增、比较基因组杂交、新一代测序技术等。与FISH及其他快速检测方法相比，QF-PCR具有操作简单，无需培养，可大样本上机操作，价格低廉等多项优点。国外大样本的研究也证实，选用多个特异性高的STR位点进行QF-PCR检测与常规染色体核型分析技术吻合度高，可显著降低进行产前诊断染色体核型分析的必要性[6]。因此我院采用QF-PCR作为快速诊断法。

我院所选STR位点借鉴国外权威文献及其他上级医院的实践经验[7]，杂合度多数在0.8以上，能提供高度的遗传信息，较好的满足了实验要求。21、18、13及性染色体上分别选用3、4、4个STR位点，所有18例染色体非整倍体标本全部检出，无一例漏诊，检出率达100%。

因STR可能存在种族及地区差异，因此，选用的STR位点及数目不同，对非整倍体染色体病的检出有较大差异[8]。本研究结果显示，21-号染色体上如仅选用2个STR位点，对二倍体的辨别率能达到85%～90%，三倍体的检出80%～90%，STR位点增加至3个，21-三体的检出率可达到100%。18号染色体选用4个STR位点检测率分析，无假阳性假阴性病例出现，因此认为4个STR位点是适宜的。选用4个STR位点检测分析，5例性染色数目异常全部检出，无漏诊。由此可见，QF-PCR检测结果与检测位点的选择及STR位点的杂合度高低密切相关。

此外，染色体核型分析正常的孕妇中有4例QF-PCR怀疑异常：一例染色体核型46，XY，羊水QF-PCR在21号染色体三个STR位点上均显示为单峰，父母双方在同样的STR位点上有相同的峰，因担心出现单亲二倍体情况，将标本送至外院，在21号染色体上选取7个STR位点再次分析，原有的3个位点仍出现纯合情况，另4个位点出现双峰，结果显示为二倍体。另有2例染色体核型示46，XX，但性染色体上3个STR位点出现纯合现象，QF-PCR提示不排除为X单体、三体或二倍体。以上3例判断有误考虑主要与STR选择位点偏少出现纯合有关。解决办法是尽可能选择杂合度高，并扩展更多的STR位点以达到检测目的[9]。

还有一例两次检测均示D21S1411未显示，不能排除部分单体，染色体核型及彩超未见异常，孕妇拒绝进一步检查，胎儿娩出后随访半年未见异常。因未做父母双方相应位点检测，STR绝大多数位于非编码区，故不能排除是否是由于无临床意义的异染色质变异导致。

实验选取的试剂盒在13号染色体上也选用了4个STR位点，但1 035例标本中未发现有13-三体，考虑与13-三体发病率低以及绝大部分自然流产有关。试剂盒生产厂家能否设计更适应的STR位点组合，在不增加反应体系的情况下适当减少13-三体上STR位点，增加21及X染色体上STR位点，以减少21及性染色体上出现纯合难以分析的局面。因为即使是漏诊13三体，后续的产前超声检查也能检出，但21-三体及性染色体数目异常超声难以检出。

此外1 035例中有9例染色体结构异常超出QF-PCR检测范围未能检出。国外文献报道QF-PCR不能检测出染色体平衡异位及异常核型＜15%三体细胞或＜20%单体细胞存在时的嵌合体[10]。虽然QF-PCR有很高的准确性，但单独使用QF-PCR进行产前诊断仍值得商榷[11]，本研究中，虽然18例染色体非整倍体QF-PCR均检出，但有4例QF-PCR提示异常标本最后检查正常，而且9例染色体结构异常QF-PCR不能检出，因此考虑中国的医疗环境，我们认为将QF-PCR作为染色体核型分析的一种补充检查，更为适宜。

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Value of quantitative fluorescent polymerase chain reaction in the rapid prenatal diagnosis of commonchromosomal aneuploidies.

JI Yan,ZHU Jin,LU Yan.Prenatal Diagnosis Center,Huizhou Municipal Central Hospital, Huizhou 516001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the value of quantitative fluorescent-polymerase chain reaction(QF-PCR)in the prenatal diagnosis of common chromosomal aneuploidies.MethodsA total of 1 035 pregnant women received prenatal diagnosis in our hospital from January 2013 to June 2014 were selected,which were all tested by karyotype analysis and QF-PCR.The results of the two methods were compared.ResultsAmong the 1 008 cases that were normal by karyotype analysis,4 were abnormal in QF-PCR,in which 1 was proved to be normal by follow-up and 3 were proved to be normal by short tandem report(STR)．Eighteen cases were diagnosed as abnormal involving chromosome 21,18, 13,X and Y both by karyotype analysis and QF-PCR,including 1 case of trisomy mosaicism 18 and 1 cases of translocation trisomy 21.The coincidence rate was 100%.ConclusionQF-PCR could provide rapid and effective diagnosis for chromosomal aneuploidies,but misdiagnosis may still occur.The appropriate STR combination can improve the detection efficiency.It is an efficient and reliable method for rapid prenatal diagnosis,which provides an important supplement for karyotype analysis.

Quantitative fluorescent polymerase chain reaction(QF-PCR);Aneuploidy;Prenatal diagnosis; Short tandem report(STR)

R714.15

A

1003—6350（2016）01—0056—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.01.020

2015-05-05)

广东省惠州市科技计划项目(编号：2012Y020)

纪妍。E-mail：jiyanqurong@163.com