硝酸镓和多黏菌素B抑制耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌生长的作用

王浩平，郑淑华，穆小萍，黄瑞玉，卢春敏

(1.广东省人民政府机关门诊部，广东广州510030；2.广东省妇幼保健院检验科，广东广州511400)

硝酸镓和多黏菌素B抑制耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌生长的作用

王浩平1，郑淑华2，穆小萍2，黄瑞玉2，卢春敏2

(1.广东省人民政府机关门诊部，广东广州510030；2.广东省妇幼保健院检验科，广东广州511400)

目的评价硝酸镓和多黏菌素B对临床分离的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌生长的抑制作用，分析其抗菌机制。方法采用微量稀释法检测硝酸镓和多黏菌素B对20株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的抑制作用，观察两者联合应用的抑菌情况。结果试验菌株对硝酸镓和多黏菌素B均敏感，硝酸镓对试验菌株的最小抑菌浓度(MIC)均为16 μmol/L，多黏菌素B对试验菌株的MIC均为≤2.0 μg/ml，两者联合应用对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌生长有协同抑菌作用。结论硝酸镓和多黏菌素B对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌有明显抑菌效果，有望成为控制其蔓延感染有效的治疗药物，为临床治疗这类难治细菌感染提供药物选择。

硝酸镓；多黏菌素B；碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌；抑制作用

碳氢霉烯类是治疗鲍曼不动杆菌严重感染的主要药物，近年来此类药物的广泛使用，使得鲍曼不动杆菌对碳青酶烯类的耐药率不断上升，给临床治疗带来极大困难[1-2]，因而寻求一种有效的抗菌药物或新的治疗方法尤其重要。铁离子是细菌生长的必须营养品，硝酸镓可通过干扰细菌的铁离子代谢而实现抑菌作用[3-4]，多黏菌素B对细菌外膜具有快速穿透性的特点，亦可辅助其他抗菌药物穿透细菌外膜进入细菌细胞内[5]，以达到杀灭细菌的作用，本研究应用硝酸镓和多黏菌素B作用于鲍曼不动杆菌碳青霉烯类耐药株，观察两者是否对其有抑制生长的效果，以及两者联合应用的抑菌情况，探求能否将硝酸镓和多黏菌素B作为一种临床有效的抗菌方法。

1 材料与方法

1.1 菌株来源菌株来自广东省妇幼保健院检验科2012年1月至2014年12月的临床患者标本分离株20株，经法国生物梅里埃公司的VITEK2-compact鉴定系统和药敏试验鉴定并确定为碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌，菌株间没有重复株。

1.2 试剂与仪器培养基胰酶大豆肉汤(TSB)购自美国BD公司产品，硝酸镓购自Sigma-Aldrich公司，多黏菌素B购自美国Amresco公司，无菌96孔聚苯乙烯U型微量板为德国Greiner产品，酶标仪为Thermo M ΜLTISKAN MK3。

1.3 方法

1.3.1 硝酸镓和多黏菌素B药物浓度配制采用倍比稀释方法，用TSB将硝酸镓稀释成一系列不同浓度，由高到低依次为64 μmol/L、32 μmol/L、16 μmol/L、8 μmol/L、4 μmol/L、2 μmol/L，用相同方法将多黏菌素B稀释到浓度分别为8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml。

1.3.2 硝酸镓和多黏菌素B的抑菌活性检测采用微量肉汤稀释法，各试验菌株接种TSB，37℃孵育8 h，用生理盐水将菌液调至0.5麦氏比浊标准，再用TSB稀释1:100，使含菌量为106CFU/ml，然后在无菌96孔聚苯乙烯U型微量板每孔接种100 μl菌液，设置上下复孔，第一孔加入无菌液培养基为空白对照，第二孔加入不含药物菌液为阳性对照，第三孔至第八孔各孔加入上述配制好的药物100 μl，使硝酸镓药物终浓度依次为32 μmol/L、16 μmol/L、8 μmol/L、4 μmol/L、2 μmol/L、1 μmol/L，多黏菌素B药物终浓度依次为4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml、0.125 μg/ml，将微孔板震荡1 min，使各孔内溶液混匀，加盖并用胶纸密封以减少孵育过程中的蒸发，置湿盒内37℃培养24 h后检测菌液OD600的值，观察不同药物浓度的抑菌情况，以试验孔中无细菌生长的最低药物浓度为该药物的MIC值。

1.3.3 硝酸镓和多黏菌素B联合应用抑菌试验采用微量肉汤稀释法，在无菌96孔聚苯乙烯U型微量板每孔接种100 μl菌液，将上述配好的不同浓度的硝酸镓和多黏菌素B两种药物按棋盘法设计，两两组合各加入50 μl，使得每个U型孔中含有不同浓度的硝酸镓与多黏菌素B，及单独含有不同浓度的单药硝酸镓与多黏菌素B，同时加入无菌液培养基设置空白对照孔，加入不含药物菌液设置阳性对照孔，震荡混匀，加盖并用胶纸密封以减少孵育过程中的蒸发，置湿盒内37℃培养24 h后检测菌液OD600的值，观察硝酸镓和多黏菌素B联合应用对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的抑菌情况。

2 结果

2.1 硝酸镓的抑菌活性结果显示硝酸镓有抑制各株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌生长的作用，各菌株的抑制效果无差异，抑制活性曲线呈现一致性，当硝酸镓浓度＞16 μm/L时，基本检测不到病原菌的存在，其MIC值为16 μm/L。菌液浓度监测变化趋势见图1。

图1 硝酸镓抑菌活性曲线

2.2 多黏菌素B的抑菌活性多黏菌素B能抑制各株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的生长，且抑菌效果接近，20株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌对多黏菌素B的MIC值均≤2 μg/ml，MIC值分布情况为0.5 μg/ml 6株、1.0 μg/ml 12株、2.0 μg/ml 2株。抑菌活性曲线，见图2。

图2 多黏菌素B抑菌活性曲线

2.3 硝酸镓和多黏菌素B协同抑菌作用结果显示在碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的抑菌活性试验中，硝酸镓和多黏菌素B联合应用能互相增强抑菌效果，当硝酸镓终浓度为4 μmol/L，多黏菌素B终浓度为0.25 μg/ml时，基本检测不到病原菌的存在，两种药物联合应用的MIC值均比单药MIC值小，曲线见图3。

图3 硝酸镓和多黏菌素B协同抑菌作用曲线图

3 讨论

鲍曼不动杆菌是引起医院内感染的重要病原菌，而碳氢霉烯类是治疗鲍曼不动杆菌严重感染的首选药物，但是，近年来随着亚胺培南、美罗培南等碳青酶烯类抗菌药物在临床上的广泛应用，其耐药率呈上升趋势，文献报道鲍曼不动杆菌耐碳青酶烯类抗菌药物日益增多[1-2]，目前临床针对此类耐药菌株的抗生素治疗手段极其有限，给临床治疗带来严峻的挑战。

铁离子是鲍曼不动杆菌的重要营养品，可以保持菌体内各类酶的活性并产生细菌毒素，酶类的激活需要铁离子的参与，如果缺乏铁离子则酶的活性将受到影响，甚至影响细菌发挥毒性作用[3-4]，由此可见铁对鲍曼不动杆菌来说非常重要，因此本文考虑将铁离子去除而抑制细菌生长，抑制其发挥毒性作用，而硝酸镓的镓离子可以与铁离子竞争，限制细菌对铁的摄取和利用，干扰细菌铁代谢途径而抑制其生长，具有较强的抗菌作用。多黏菌素B是多粘芽胞杆菌产生的一组多肽类抗生素，主要通过破坏细菌的细胞膜，导致细胞膜内细菌主要物质外漏，影响核质和核糖体功能，具有较强的杀菌作用并且不容易产生耐药性，多数文献也报道多黏菌素B对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的生长有明显抑制作用[5-6]。

本研究结果显示硝酸镓和多黏菌素B对各株临床标本分离的碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌有明显的体外抑制生长作用，两者同时作用于耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌，具有协同抑菌作用。硝酸镓的镓离子半径和效价与三价铁离子一样，鲍曼不动杆菌的生物反应系统无法区分两种离子，可以用镓离子模仿三价铁离子与细菌体内的各种酶结合，使到需要铁离子激活的所有酶均不能正常激活而失去生物学功能，最终通过干扰细菌铁离子代谢途径实现其抑菌功能，从而抑制鲍曼不动杆菌的生长[7-8]。多黏菌素B通过破坏鲍曼不动杆菌的细胞膜，对细菌外膜具有快速穿透性的特点，导致细胞膜内主要物质外漏[9]，破坏鲍曼不动杆菌的生物功能，同时细胞膜破坏后，可辅助硝酸镓穿透细菌外膜进入细菌细胞内，替换铁离子，干扰细菌体内的铁代谢途径，使碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌菌体内大部分酶因不能正常激活而发挥不了作用，最终抑制细菌生长，表现出硝酸镓和多黏菌素B两者联合使用的协同作用，同时可减少各自的使用量，降低药物肾脏损害的程度，从而解决耐药菌的治疗问题。

目前鲍曼不动杆菌碳青霉烯类耐药率呈现上升的趋势，临床治疗也出现困难，本研究从另一个角度考虑如何治疗耐药的鲍曼不动杆菌的感染，硝酸镓联合多黏菌素B对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌有明显的协同抑制生长作用，有望成为控制其蔓延感染有效的治疗药物，为临床治疗这类难治细菌感染提供药物选择。

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Inhibitory effect of gallium nitrate and polymyxin B on the growth of carbapenem-resistant Acinetobacterbaumannii.

WANG Hao-ping1,ZHENG Shu-hua2,MU Xiao-ping2,HUANG Rui-yu2,LU Chun-min2.1.Outpatient Department,Guangdong Provincial People's Government,Guangzhou 510030,Guangdong,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,Guangdong Women and Children Hospital,Guangzhou 511400,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the ability of gallium nitrate and polymyxin B for inhibiting the growth of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii isolated from patients,and to analyze their mechanisms.MethodsThe inhibitory activity of gallium nitrate and polymyxin B against 20 carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii strains was tested by using microtiter plates.The activity of the combination of gallium nitrate and polymyxin B was also observed.ResultsThe tested strains were sensitive to gallium nitrate and polymyxin B.The minimum inhibitory concentration(MIC)of gallium nitrate was 16 μmol/L,and the MIC of polymyxin B was less than 2.0 μg/ml.Synergistic inhibitory effect for carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii was observed when gallium nitrate and polymyxin B were applied in combination.ConclusionThe bacteriostasis of gallium nitrate and polymyxin B for carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii was obvious.It could be used for controlling the infection of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii.

Gallium nitrate;Polymyxin B;Carbapenem-resistantAcinetobacter baumannii;Inhibitory effect

R378

A

1003—6350（2016）01—0073—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.01.026

2015-08-21)

广东省医学科学技术研究基金(编号：A2013173)

王浩平。E-mail：489611421@qq.com