Leaner小鼠P/Q型钙通道功能及其在海马神经元突触传递中的作用*

许晓利，　杨友华，　李　琴，　Ilya Bezprozvanny

1江汉大学医学院基础医学部，武汉　430056

2美国德克萨斯州立大学西南医学中心生理学系，达拉斯　75390



Leaner小鼠P/Q型钙通道功能及其在海马神经元突触传递中的作用*

许晓利1#，杨友华1#，李琴1，Ilya Bezprozvanny2

1江汉大学医学院基础医学部，武汉430056

2美国德克萨斯州立大学西南医学中心生理学系，达拉斯75390

摘要：目的研究P/Q型钙通道在小鼠海马神经元的突触传递中的重要作用。方法①培养小鼠海马神经元用于研究，采用全细胞膜片钳记录技术，记录培养的对照组并趾症小鼠(oligosyndactyly，OS)和Leaner小鼠海马神经元钙离子电流；②刺激突触前细胞，记录突触后神经元抑制性突触后电流，观察对照组OS抑制性突触后电流对钙离子浓度的依赖性。③比较对照组OS和Leaner小鼠的突触后电流中各种钙通道在突触传递中所占比例。④转染长片段P/Q型质粒以恢复Leaner小鼠细胞因突变而引起的C末端过短所造成的功能缺失。结果①抑制性突触后电流中P/Q型钙通道与钙浓度密切相关，在正常钙浓度的条件下，细胞外钙浓度为2 mmol/L时，P/Q型钙通道起主要作用，当细胞外钙浓度升高到4 mmol/L后，P/Q型钙通道功能所占比例部分由N型通道代替。②对照组OS和Leaner小鼠培养的海马神经元钙通道中P/Q型钙通道有很大的不同，突变小鼠中P/Q型钙通道功能减低，由其它通道补偿代替。③在培养的海马神经元记录的突触后电流显示Leaner小鼠的P/Q功能基本丧失，由N型和其他型所取代。④通过外源性转染含长片段P/Q型通道的质粒可以基本补偿P/Q型钙通道功能。结论Leaner小鼠海马P/Q型钙通道功能降低是导致突触传递功能减少的重要因素。

关键词：Leaner小鼠；海马神经元；P/Q型钙通道；抑制性突触后电流；突触传递

电压门控钙通道(voltage-gated calcium channels，VGCCs)，可分为低电压激活(LVA)和高电压激活(HVA)两类，高电压激活钙通道包括P/Q，N，R和L型钙通道，是钙离子进入细胞的主要通路。P/Q型VGCCs是突触前神经末梢主要的VGCC类型之一，在突触前神经元细胞膜去极化，导致细胞外钙离子内流进入神经末梢，引起突触囊泡释放神经递质中起重要作用。

人类遗传性神经系统疾病，如发作性共济失调2型(EA2)、家族性偏瘫性偏头痛1型(FHM-1)、脊髓小脑性共济失调6型和失神发作伴随共济失调，与各种突变的CACNA1A基因相关，在CACNA1A基因自发突变小鼠呈现出退行性神经表现。VGCCs中P/Q型α1A亚基由这个基因编码形成[1-2]。Tottering(tg)小鼠是由于编码钙通道Cav2.1(P/Q型)(α1A)的第8条染色体突变，引起运动失调、惊厥、癫痫小发作等与人类的神经症状类似。Leaner(tgla.Cacna1atg-la)是一种表现更为严重的等位基因，许多tgla/tgla纯合子在断奶时死亡。Leaner突变体由于编码Cav2.1钙通道的单一碱基的突变(G突变为A)导致读码框移位，引起C末端过短，失去了与突触调节蛋白CASK和Mint的结合区。为了研究Cav2.1 C末端在钙通道的突触传递中的重要作用，我们培养Leaner小鼠海马神经元用于研究，我们的研究说明，Leaner小鼠P/Q型的功能与突触传递有重要关系，钙通道的功能减弱是导致突触传递减少的重要因素。

1材料与方法

1.1实验动物

我们从Louise Abbott博士(美国德州农工大学)获得Leaner雌雄小鼠进行繁殖，Leaner由Louise Abbott博士实验室利用并趾症小鼠(oligosyndactyly，OS)突变而获得，经繁殖后获得的第2、第3趾并趾的为(Os/+)/(+/tgla)为杂合子，基因检测与父母等同，在实验中OS小鼠代替野生型而作为Leaner突变小鼠的对照组。繁殖后获得的正常的没有并趾的小鼠为Leaner纯合子(+/tgla)/(+/tgla)。并趾纯合子小鼠在子宫内死亡。

1.2细胞培养

参照已经发表的方法[3-4]，新生1日龄的小鼠断头处死，迅速取出大脑，并放置在培养皿用无菌磷酸缓冲液PBS清洗。在解剖显微镜下，于冰冷的PBS中彻底去除血管和膜并分离出海马组织。将组织切成约1 mm×1 mm×1 mm的小块，然后在无菌的含0.25%胰蛋白酶PBS(37℃)中孵育30 min，800 r/min离心2 min。在含牛血清白蛋白1 mg/mL，DNA酶Ⅰ 10 mg/mL，大豆胰蛋白酶抑制剂0.5 mg/mL无菌的PBS中，用巴斯德移液器轻轻吹打分离的细胞，以达到机械分离细胞的作用。1 000 r/min离心5 min后，将细胞重新悬浮在含有10%小牛血清，1×B27，10 g/L葡萄糖，10 mg/L青霉素/链霉素，DMEM/F12培养液中，培养物置于37℃、5%CO2恒温恒湿培养箱培养。分离的细胞初始接种于DMEM/F12培养液。24 h后，将培养液更换为新鲜的含0.5 mmol/LL-谷氨酸、70%的DMEM/F12和30%的神经基础培养液(Life Technologies公司)混合物中，每3~5 d换液1次(1/2换液)。

1.3全细胞电流记录

使用膜片钳Axopatch 200B放大器，滤波频率2 kHz；再经数/模转换器Digidata1200输入计算机进行采样贮存，pClamp8.0软件分析。信号过滤采用1 kHz，记录电极2~6 MΩ电阻，细胞电容(33±17)pF，在记录过程中实时监测系统电阻(<20 MΩ)，所有的药物均按照制造商的规格制备，在记录同时采用排管重力式给药，实现快速更换细胞外溶液。

在体外培养7～10 d的海马细胞上记录钙电流，电压钳位于-80 mV，细胞外液中含10 mmol/L Ba2+作为主要离子而避免钙依赖性调节。每次刺激间隔10 s，每个记录的细胞根据细胞大小来计算电流幅度，记录钙电流的细胞外液(mmol/L)：TEACl 140，BaCl210，HEPES-CsOH 10，Glucose 20，河豚毒素(TTX)0.001，pH 7.3用TEA-OH调定，渗透压310 mOsm/L。细胞内液(mmol/L)：CsCl 110，EGTA 10，ATP-Mg 4，GTP-Na 0.3，HEPES 25，三磷酸肌酸10，肌酸磷酸激酶20 U/mL，pH7.3用CsOH调定，渗透压290 mOsm/L。

抑制性突触后电流(inhibitory post-synaptic currents,IPSC)在14～18 d记录低数量培养的海马细胞(每个盖玻片约5 000细胞)，电压钳位于-70 mV研究突触传递，细胞外液根据需要分别含2 mmol/L和4 mmol/L的Ca2+和Mg2+，使用局部细胞外双电极不锈钢刺激电极CBAEC(MX21AE，FHC Inc.公司)。胞外刺激由型号2100独立的脉冲刺激器控制(A-M System，Inc公司)，突触前细胞每间隔10 s被去极化到0 mV/ 1 ms而产生动作电位，相应的在突触后神经细胞上使用Axon 200B膜片钳放大器(Axon instrument Inc公司)记录IPSC，每种药物状态下记录20个反应后取平均值。

记录IPSC的细胞外液(人工脑脊液ACSF，mmol/L)：NaCl 140，KCl 5，MgCl21，CaCl22.0，HEPES 10，Glucose 10，(pH7.4用NaOH滴定或调定，渗透压320～330 mOsm/L)。电极内液(mmol/L)：KCl 100，EGTA 2，ATP-Mg 4，GTP-Na 0.3，HEPES 30，三磷酸肌酸10，肌酸磷酸激酶20 U/mL，pH7.3用KOH调定，渗透压290 mOsm/L。

在IPSC所有的实验中，细胞外的记录液加入10 μmol/L CNQX和50 μmol/L AP5以阻断AMPA受体。每次实验前加入QX314到细胞内液中，以阻止钠电流。

所有的钙通道阻断剂购自Peptides International公司，所有其它试剂购自Sigma公司，在细胞外记录溶液中稀释至其最终浓度用于体外电生理学实验。

1.4统计学分析

2结果

2.1细胞外不同钙离子浓度对突触传递的影响

为了比较不同钙离子浓度对突触传递的影响，我们先设计两组不同的实验，一组实验中细胞外液为普通的ACSF，钙离子浓度为2 mmol/L，另一组实验使用高钙即钙离子浓度为4 mmol/L，同时观察突触后电流，分别给细胞添加不同钙通道阻断剂。在体外培养14 d的神经细胞突触已经形成，当用电刺激突触前细胞而诱发动作电位后，在突触后神经细胞上可记录到激活的突触后电位。如图1所示，改变细胞外液中钙离子浓度从2 mmol/L到4 mmol/L，突触后电流持续时间延长，我们主要观察了不同钙通道阻断剂对突触后电流的影响，欧米伽-芋螺毒素AgaIVA是P/Q型钙通道的特异性阻断剂，在通常的钙离子2 mmol/L浓度下，AgaIVA几乎阻断了70%的突触传递，就是说P/Q型钙通道在正常突触传递中起主要作用。欧米伽-芋螺毒素GVIA是N型钙通道的特异阻断剂，在通常的钙离子2 mmol/L浓度下，GVIA的阻断作用小于AgaIVA，就是说N型钙通道所占比例小于P/Q型钙通道，当将细胞外钙离子浓度升高到4 mmol/L时，N型钙通道的作用占比几乎与P/Q型的相同。

2.2Leaner小鼠和OS对照组钡电流的比较

在对照组小鼠OS和Leaner小鼠上记录电压激活的钡电流代替钙电流而避免钙依赖的其它通道激活，电压钳位于-80 mV，改变电位到0 mV，记录到的钡电流类似钙电流但幅度高于钙电流，当电流稳定后，加GVIA在细胞上，电流幅度减小，待电流稳定后再依次加AgaIVA、硝苯吡啶和镉，记录各种不同钙通道阻断剂对钡电流的影响。结果发现，在突触前的钙通道表达中，Leaner小鼠的P/Q型所引导的电流小于对照组的电流幅度，Leaner小鼠与对照组OS小鼠有明显差异，Leaner小鼠P/Q型钙通道的减弱主要由N型通道所代偿(图2)。

使用不同的钙通道阻断剂研究各型钙通道所占比例。GVIA阻断N型，AgaIVA阻断P/Q型，R型由Cd2+阻断。在对照组OS小鼠上记录抑制性突触后电流，抑制性突触后电流中P/Q型钙通道与钙浓度密切相关，在正常钙浓度(2 mmol/L)的条件下，P/Q型钙通道起主要作用(70%)，当细胞外液中钙离子浓度升高到4 mmol/L后，P/Q型钙通道功能所占比例部分由N型通道代替。图1　细胞外钙离子浓度对P/Q型钙通道激活的影响Fig.1 Effect of extracellular Ca2+concentrations on P/Q type Ca2+channels

对照组OS与Leaner突变小鼠海马神经元上钙电流中P/Q型所占比例有所不同，在Leaner小鼠上P/Q型钙电流所占比例减少，主要由N型所补偿。*P<0.05图2　OS和Leaner小鼠培养的海马神经元钙电流的比较Fig.2 Comparison of Ca2+currents in hippocampal neurons between OS and Leaner transgenic mice

2.3Leaner小鼠和OS对照组小鼠抑制性突触后电流的比较

在体外培养14 d的OS和Leaner海马神经元上，观察突触传递过程中各种钙通道所占比例是否有相应的改变。在前期IPSC的研究中，我们发现在正常钙离子浓度下由于Leaner小鼠P/Q型钙通道的缺失，导致P/Q型钙通道对突触传递的贡献由对照组的70%左右变为0%，由于篇幅所限，这部分的数据没有列入。所以我们采用提高钙浓度方式来研究IPSC，结果表明，提高钙离子浓度在一定程度上增强了P/Q型在IPSC突触传递中的作用，但还是远低于对照组OS小鼠。结果如图3所示，当刺激突触前神经元后，在突触后神经细胞上记录到的抑制性突触后电流在OS与Leaner海马神经元上发生了相应的改变，在对照组OS海马神经元上，抑制性突触后电流中N型与P/Q型所占比例差别不大，分别是40.4%和43.7%，而在Leaner小鼠的海马神经元上P/Q型通道所占比例明显减少，只有12.2%，取而代之，N型通道所占比例占主要成分，约占80%以上，说明Leaner小鼠P/Q型通道的功能减弱。

IPSC中P/Q型钙通道在对照小鼠OS海马神经元上所占比例为43.7%，而在Leaner突变小鼠只占12.2%，主要由N型所补偿代替。*P<0.05图3　OS和Leaner小鼠培养的海马神经元IPSC的比较Fig.3 Comparison of IPSC in hippocampal neurons between OS and Leaner transgenic mice

2.4Leaner小鼠培养神经元的体外补偿效应

Leaner小鼠因缺乏大片段的C末端而不能与调节蛋白Mint和CASK结合，而使突触传递功能减弱，为了补偿因缺失C末端片段造成的P/Q型通道功能减退，我们在体外培养11 d的海马神经元上，使用磷酸钙转染带有表达C末端的质粒后，利用GFP荧光来检测表达C末端的神经细胞，探索P/Q型通道的功能恢复状况。我们使用2种质粒转染细胞，一种是Cav2.1-ASAP-IRES-EGFP(Q13)，另一种是Cav2.1-DDWC-IRES-EGFP(Q14)，转染Cav2.1-ASAP的海马神经元将表达短的P/Q型Cav2.1通道，而转染Cav2.1-DDWC的海马神经元将表达长的P/Q型Cav2.1通道，长的P/Q型Cav2.1通道具有结合Mint和CASK的位点。IRES介导GFP蛋白的表达，在荧光显微镜下，在GFP表达的OS和Leaner海马神经元上形成全细胞记录后，刺激与表达GFP的神经元邻近的不表达GFP的突触前神经元，记录GFP表达的OS和Leaner海马神经元的抑制性突触后电流，利用GVIA抑制N型钙通道，利用AgaIVA抑制P/Q型钙通道。如图4所示，在高钙的条件下，OS对照组中N型钙通道和P/Q型钙通道在突触后电流中所占比例差别不大(n=12)，Leaner小鼠的海马神经元突触传递以N型为主，P/Q型的突触传递功能减退(n=10)。而被转染了Q14的GFP阳性的含有DDWC的细胞补偿P/Q型钙通道后，P/Q通道功能增强，部分补偿了P/Q型的通道功能(n=3)，标示为Leaner-营救(Rescued)；在同样转染Q14的细胞中，记录GFP表达阴性的细胞，其P/Q型通道功能与Leaner小鼠接近，以N型钙通道为主(n=4)；与之相对应，表达Q13(ASAP)的GFP阳性神经元未能恢复P/Q型钙通道功能(n=4)。

利用转染外源含长片段C末端的质粒可以部分恢复Leaner突变小鼠海马培养神经元的功能。我们采用Q13(Cav2.1-APSP-IRES-EGFP)短片段及不含DDWC长片段的Q14作为对照和Q14(Cav2.1-DDWC-IRES-EGFP)长片段来转染培养的Leaner小鼠的海马神经元，结果显示，被转染的Q13由于是短片段，不含Mint-PDZ和Cask-SH3结合位点，不能恢复P/Q型的通道功能；而转染Q14含有DDWC长片段的细胞，其P/Q型功能有所恢复，不含DDWC长片段的Q14的功能不变。图4　Leaner突变小鼠培养的海马神经元的修复Fig.4 Repair of hippocampal neurons in Leaner transgenic mice

3讨论

突触是神经元之间有效和快速交流的特殊结构，突触蛋白间的相互作用通过突触调节蛋白来调节[5]，钙通道激活囊泡释放是快速突触传递的关键[6]，在突触前末梢，高电压激活(HVA)钙通道包括P/Q，N，R和L型钙通道，介导突触末梢的快速钙离子内流进入突触前末梢，激发囊泡融合，神经递质释放[6-7]。P/Q型VGCCs是突触前神经末梢主要的VGCC类型之一，在突触前神经元细胞膜去极化，导致细胞外钙离子内流进入神经末梢，引起突触囊泡释放神经递质中起重要作用。为了研究细胞外不同钙离子浓度对突触传递的影响，我们培养小鼠海马神经元进行研究，结果显示培养的对照组海马细胞处于4 mmol/L高钙浓度的条件下，激活的钙通道所占的比例有所改变，原来占主导的P/Q型减少而N型通道激活增加。我们的研究说明，细胞外不同钙离子浓度对突触传递有很大的影响，在通常的钙离子(2 mmol/L)浓度下，在正常突触传递中P/Q型钙通道起主要作用。当将细胞外钙离子浓度升高到4 mmol/L时，N型钙通道的作用占的比例几乎与P /Q型的相同。

自然发生的α1A亚基突变小鼠导致P/Q型钙通道功能缺失而降低神经元上P/Q型钙通道的钙电流的幅度[8-9]。本实验也提供了这方面的依据，为了研究Cav2.1 C末端在钙通道的突触传递中的重要作用，本实验培养对照组OS和Leaner小鼠海马神经元进行研究。结果显示，Leaner小鼠的P/Q型所引导的钙电流小于对照组的电流幅度，Leaner小鼠与对照组OS小鼠有明显差异，在Leaner小鼠P/Q型钙通道功能减弱的同时N型钙通道增强，这说明Leaner小鼠P/Q型钙通道功能主要由N型钙通道所补偿。

抑制性和兴奋性突触在中枢如丘脑、皮层及小脑中α1A亚基突变引起传递缺失可能与癫痫和惊厥有关[9-10]。为了进一步了解α1A突变对突触传递的影响，本实验重点研究了高电压激活钙通道的功能和突触传递的关系。当培养的海马神经元突触形成后，刺激突触前神经元，在突触后神经细胞上记录到的抑制性突触后电流在OS与Leaner海马神经元上发生了改变，在对照组OS海马神经元上，抑制性突触后电流中N型与P/Q型所占比例差别不大，分别是40.4%和43.7%，而在Leaner小鼠的海马神经元上P/Q型通道所占比例明显减少，只有12.2%，N型通道所占比例明显增加，约占80%以上，与对照组相比，Leaner小鼠P/Q型通道的功能明显减弱，说明抑制性突触传递中Leaner小鼠由于基因的突变导致P/Q型通道功能减弱，而由N型钙通道功能增强来补偿P/Q型的功能缺失。

突触前膜的去极化激活P/Q和N型钙通道，大量钙离子快速内流，细胞质内游离钙浓度升高，尤其是靠近VGCC入口处。本实验提示，在正常钙离子浓度的条件下，P/Q型钙通道起主要作用；细胞外钙离子浓度升高后，P/Q型和N型钙通道的作用相差不大。这也提示，突变后的Leaner小鼠突触传递，就需要升高细胞外的钙离子浓度才能实现，使Leaner小鼠的突触传递有可能更多地依赖N型钙通道的激活来完成。有效的神经递质的释放既取决于钙离子的浓度但不呈直线关系，通常神经递质的释放更迅速，也取决于VGCC与钙感受器的距离，单一的钙通道亚型(N或P/Q型)或几种钙通道的相互作用，形成相互重叠的钙结合域，融合囊泡而引发递质释放[11-12]。在这些突触上使用作用较慢的钙螯合剂EGTA可以部分抑制神经递质释放[13-14]，这说明部分VGCC位于突触囊泡远端，需要几种钙结合域的相互作用才可引发递质释放。钙离子以高度协助的方式作用于钙通道感受器，说明了钙离子通过VGCC内流的很小变化可以导致突触传递的很多变化。但不是所有的突触都需要钙结合域的相互作用，单一的钙通道含有显著强大的钙信号，取决于生理性高浓度细胞外钙，足以激发快速的囊泡释放[11-12]。在多数中枢突触P/Q和N型相互共同控制神经递质的释放，突触前P/Q型在成熟突触调节递质释放中起主要作用，部分是由于这些通道更有效地与胞吐作用相连，可能是更接近突触囊泡的缘故[15]。N型通道调节突触传递的作用随突触的不同而不同，更多的作用在调节突触成熟前的阶段，N型钙通道的效率低于P/Q型，可能是N型的距离释放位点远一些的缘故[16]。P/Q和N型VGCCs调节的不同，在中枢突触中的作用还不是很清楚，在tgla/tgla小鼠小脑浦肯野细胞上的研究显示，这种基因缺失与P/Q型钙电流显著降低有关[17]。通道平均开放的时间比正常的短3倍，全细胞电流也降低。在前脑神经元tgla/tglaP/Q型的功能减低完全由L型VGCC补偿[18]。在突变体小鼠，兴奋性突触传递在丘脑的缺失已有报道[19]。在神经末梢由于遗传的钙通道突变导致的P/Q型VGCC功能的变化可能显著地改变突触信号传递，导致钙依赖的神经递质释放和神经兴奋性的变化。迄今研究最清楚的分别是丘脑和小脑的突触传递与惊厥[10，20-21]有关。突触传递的改变提示这些突变或许会改变突触末梢P/Q型钙通道的功能，导致钙离子内流和神经递质释放减少。

Cav2.1钙通道的单一碱基的突变(G突变为A)导致读码框移位，引起C末端过短，失去了与突触调节蛋白Mint和CASK的结合区，是Leaner小鼠P/Q型钙通道的功能减弱，导致突触传递减少的重要因素。我们通过外源转染长片段含Mint和CASK结合位点的质粒，以期恢复因突变造成的结合位点缺失，使其恢复功能。结果显示被转染了长片段Q14的GFP阳性的含有DDWC的细胞补偿P/Q型钙通道后，P/Q通道功能增强，部分补偿了P/Q型的通道功能，而在同样转染Q13的细胞中，表达Q13(ASAP)的GFP阳性神经元未能恢复P/Q型钙通道功能，这从另一方面提示，P/Q型钙通道是突触传递的主要成分。

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(2015-05-27收稿)

P/Q-type Calcium Channel Function and Its Role in Synaptic Transmission of Hippocampal Neurons in Leaner Transgenic Mice

Xu Xiaoli#，Yang Youhua#，Li Qinetal

DepartmentofBasicMedicalSciences,SchoolofMedicine，JianghanUniversity，Wuhan430056，China

AbstractObjectiveTo investigate the important role of the P/Q-type calcium channel in hippocampal synaptic transmission of mice.Methods①Whole-cell patch clamp recording technique was used to detect calcium currents of hippocampal neurons isolated from mice with oligosyndactyly(OS) and Leaner transgenic mice.②Inhibitory post-synaptic currents(IPSCs)were recorded in postsynaptic neurons after stimulation of pre-synaptic neurons.The effect of different calcium concentrations on IPSCs was examined in OS mice.③The proportion of different calcium channels in IPSCs was compared between the OS mice and Leaner transgenic mice.④The exogenous plasmid containing the long fragment was transfected into hippocampal neurons to restore the function loss caused by extremely short C-terminal end in mutant cells in Leaner transgenic mice.Results①P/Q-type calcium channel played a major role in IPSCs when calcium concentrations were in a normal range(such as 2 mmol/L).When the extracellular calcium concentration increased to 4 mmol/L，some P/Q-type calcium channels were replaced by N-type channels.②P/Q-type calcium channel function was reduced in hippocampal neurons of Leaner transgenic mice，which was compensated by other channels.③Post-synaptic currents recorded in cultured hippocampal neurons indicated the function loss of P/Q-type calcium channel in Leaner transgenic mice，which was replaced by N-type and other type channels.④P/Q-type channel function could be substantially rescued by transfection of the exogenous plasmid containing the long fragment.ConclusionFunctional deficiency of P/Q-type calcium channel in Leaner transgenic mice is responsible for the decrease in hippocampal synaptic transmission.

Key wordsLeaner transgenic mice；hippocampus neurons；P/Q type Ca2+channel；IPSC；synaptic transmission

中图分类号：R338.1

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.01.007

*美国罗伯特·韦尔奇基金资助项目；美国国立卫生研究院资助项目(No.R01NS39552)

#同为第一作者

许晓利，女，1963年生，副教授，E-mail：xuxiaoli1001@163.com； 杨友华，男，1974年生，讲师，E-mail：21092308@qq.com