Gas6在胎盘或蜕膜组织中的表达及其与子痫的相关性

李绮霞，何玉兰，金玉

(广州市从化区南方医科大学第五附属医院妇产科，广东 广州 510900)

Gas6在胎盘或蜕膜组织中的表达及其与子痫的相关性

李绮霞，何玉兰，金玉

(广州市从化区南方医科大学第五附属医院妇产科，广东 广州 510900)

目的 探讨胎盘或蜕膜组织中生长阻滞特异性蛋白6(Gas6)的表达水平及其与子痫前期的相关性。方法选取2012年6月至2015年4月本院妇产科收治的42例重度子痫前期剖宫产分娩孕妇作为子痫组，42例同期正常晚期妊娠剖宫产孕妇作为对照组，采用免疫组化法分别检测两组受检者胎盘、蜕膜组织中的Gas6蛋白表达水平，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测胎盘组织Gas6 mRNA的表达，并分析Gas6 mRNA与重度子痫前期患者相关指标的关系。结果子痫组患者的收缩压、舒张压和血肌酐(Scr)分别为(163.2±16.4)mmHg、(101.4±9.5)mmHg、(60.4±13.2)µmol/L，均明显高于对照组的(119.5±8.3)mmHg、(71.6±8.3)mmHg和(41.0±11.9)µmol/L，差异均有统计学意义(P＜0.05)；子痫组患者的白蛋白(30.4±3.9)g/L、血小板(167.3±54.1)×109/L水平显著的低于对照组的白蛋白(35.1±4.2)g/L、血小板(256.0±83.7)×109/L，差异有统计学意义(P＜0.05)；子痫组患者胎盘、蜕膜组织中Gas6蛋白的表达强度均显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；子痫组患者胎盘组织中Gas6 mRNA的表达水平(0.61±0.23)显著高于对照组的(0.34±0.18)，差异有统计学意义(P＜0.05)；子痫组患者胎盘组织中Gas6 mRNA的表达水平与患者的收缩压、舒张压、Scr呈显著的正相关(r=0.417、0.382、0.405，P＜0.05)；子痫组患者胎盘组织中Gas6 mRNA的表达水平与白蛋白、血小板水平呈显著的负相关(r=-0.326、-0.314，P＜0.05)。结论子痫前期患者胎盘或蜕膜组织中Gas6高表达，并且与子痫发病有关。

胎盘；蜕膜组织；生长阻滞特异性蛋白6；子痫前期；相关性

怀孕前血压正常的孕妇在妊娠20周以后出现高血压、蛋白尿，称子痫前期，或称为先兆子痫，是妊娠期高血压疾病的五种状况之一，为妊娠期特发疾病，可影响机体各器官系统，发病率约占全部妊娠的3.9%。子痫前期患者血压控制不佳可引起严重的子痫发作，导致不良妊娠结局的发生[1]。

子痫前期的发病机制较为复杂，妊娠状态中循环血容量的增加、动脉血管内皮的损伤以及胎盘界面形成不良，或者胎盘母体面的局部炎症反应等，均可能参与到了子痫前期的发生发展过程[2]。生长阻滞特异性蛋白6(Gas6)是一种生长阻滞特异性基因编码的分泌性蛋白，其生物学功能与血管的炎症、免疫以及脂蛋白的代谢有关[3-4]。本次研究重在探讨胎盘或蜕膜组织中Gas6的表达水平及与子痫前期的发病关系，进而进一步揭示子痫前期的发病机制，并为患者的临床预后提供新的生化指标参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年6月至2015年4月收治的42例重度子痫前期在本院产科实施剖宫产分娩孕妇作为子痫组，同期正常孕晚期妊娠的在本院实施剖宫产的42例妇女作为对照组。子痫组孕妇年龄26～38岁，平均(31.6±3.8)岁，孕次(2.3±1.2)次，产次(1.4±0.4)次。对照组孕妇年龄24～36岁，平均(31.2±3.4)岁，孕次(2.2±1.3)次，产次(1.3±0.5)次。两组孕妇的年龄、孕次、产次构成等差异均无统计学意义(P＞0.05)。

1.2 纳入排除标准

1.2.1 纳入标准 (1)重度子痫前期妇女的诊断标准主要依据乐杰主编《妇产科学》第七版中的标准；(2)实验室诊断满足：收缩压/舒张压≥160/110 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)、尿蛋白≥2.0/24 h；(3)对照组孕妇来源于同期正常孕晚期妊娠的剖宫产的妇女；(4)本研究取得研究对象的知情同意并签订协议书。

1.2.2 排除标准 (1)既往具有高血压、糖尿病、慢性肝肾功能损害的患者；(2)具有精神病史的患者；(3)合并免疫系统疾病或正在使用糖皮质激素、免疫制剂的患者；(4)合并其他妊娠合并症的患者。

1.3 Gas6蛋白的免疫组化 组织采用石蜡包埋，切片机切取组织，厚度5 mm，用多聚赖氨酸处理。在脱蜡之前，将切片置于60℃恒温箱中烘烤60 min。将切片用二甲苯浸泡10 min，更换二甲苯后再浸泡10 min。水化后进行抗原修复，3%H2O2一甲醇溶液处理切片15 min，加入一抗Fascin鼠单抗100 L，37℃，湿盒孵育1 h。加入增强剂50 L，室温湿盒孵育20 min。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗50 L，室温37℃，孵育30 min。每张片子加2滴新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察。FHS-2R光学显微镜购自罗氏检测公司，相关配套试剂购自南京凯基生物科技有限公司。

1.4 RT-PCR 取冻存已裂解的组织冲洗液，按照10 000 r/min的离心速度进行离心分离，每1 mL的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 mL的氯仿，进行裂解操作，4℃冰上采用无酶的RNA冲洗液进行洗涤，再次10 000 r/min离心5 min，得到RNA。混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3 min，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 μL，37℃水浴60 min，室温放置5 min使其完全溶解，使其逆转录为cDNA。以β-actin为模版，在反应体系中加入SYBR Green 1染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得总体积达20 μL，上机，反应条件为：93℃2 min、93℃1 min、55℃2 min，共40个循环。引物设计：上游3'-5'，ATGCCGCCTCGCTGAA，5'-3'，GGCAGCGAGGCGGCTA，引物购自上海华生科技有限公司。

1.5 观察指标及评价标准 对比两组胎盘、蜕膜组织中Gas6蛋白、mRNA、收缩压、舒张压、D-二聚体、血肌酐(Scr)、血浆白蛋白、血小板计数的差异。免疫组化结果评价标准：Gas6蛋白在胎盘组织中主要定位于合体滋养层细胞的细胞质和细胞核中，在蜕膜组织中主要定位细胞质和细胞核中，呈黄色、棕黄色、褐色表达。(1)根据着色强度：0分为无色、1分为淡黄色、2分为棕黄色、3分为褐色、黑色；(2)根据阳性细胞比例：阳性细胞数目所占比例＜10%为1分、阳性细胞所占比例11%～50%为2分、阳性细胞数51%～75%为3分、阳性细胞数所占比例＞75%为4分，(-)为总分＜3分，阴性表达；(+)为3～5分，弱阳性表达；(++)为6～9分，中阳性表达；(+++)为＞9分，强阳性表达。

1.6 统计学方法 数据分析在SAS9.3软件包中处理，正态分布的计量指标采用均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用t假设检验；等级计数资料组间比较采用秩和检验；相关性分析法采用Pearson线性相关法；P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 子痫组和对照组的相关临床指标比较 子痫组患者的收缩压、舒张压、Scr水平显著的高于对照组患者(P＜0.05)，子痫组患者的白蛋白、血小板水平显著的低于对照组患者(P＜0.05)；两组间D-二聚体差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 子痫组和对照组的相关临床指标比较(±s)

表1 子痫组和对照组的相关临床指标比较(±s)

组别子痫组对照组t值P值例数42 42收缩压（mmHg）163.2±16.4 119.5±8.3 15.408＜0.001舒张压(mmHg) 101.4±9.5 71.6±8.3 15.309＜0.001 D-二聚体(mg/L) 2.7±1.4 2.3±1.1 1.456 0.094 Scr(umol/L) 60.4±13.2 41.0±11.9 7.074＜0.001白蛋白(g/L) 30.4±3.9 35.1±4.2 5.314＜0.001血小板(109/L) 167.3±54.1 256.0±83.7 5.797＜0.001

2.2 胎盘和蜕膜组织中Gas6蛋白的表达情况 子痫组患者胎盘、蜕膜组织中Gas6蛋白的表达水平均显著高于对照组(P＜0.05)，见表2、3和图1。

表2 子痫组和对照组蜕膜组织中Gas6蛋白的表达水平[例（%）]

表3 子痫组和对照组胎盘组织中Gas6蛋白的表达水平[例（%）]

图1 免疫组化结果

2.3 胎盘组织中Gas6 mRNA的表达情况 子痫组患者胎盘组织中Gas6 mRNA的表达水平均显著高于对照组(P＜0.05)，见表4，图2。

表4 两组胎盘组织中Gas6 mRNA的表达水平(±s，吸光度值)

表4 两组胎盘组织中Gas6 mRNA的表达水平(±s，吸光度值)

组别 例数Gas6 mRNA t值P值子痫组对照组42 42 0.61±0.23 0.34±0.18 5.991＜0.001

图2 子痫组和对照组胎盘组织中Gas6 mRNA表达的RT-PCR检查结果电泳图

2.4 相关性分析法 子痫组患者胎盘组织中Gas6 mRNA的表达水平与患者的收缩压、舒张压、Scr呈显著正相关(P＜0.05)；子痫组患者胎盘组织中Gas6 mRNA的表达水平与白蛋白、血小板水平呈显著负相关(P＜0.05)，见表5。

表5 相关性分析法

3 讨 论

轻度子痫前期的孕产妇妊娠20周后出现收缩压≥140 mmHg和(或)舒张压≥90 mmHg伴蛋白尿≥0.3 g/24 h或随机尿蛋白≥+，而当血压、血肌酐值、蛋白尿以及血清转氨酶等指标进一步恶化时，患者进展为子痫的概率可明显增加5%～10%[5-6]。相关妊娠期高血压以及子痫前期的病因的探讨认为，滋养细胞侵袭异常、免疫调节功能异常、内皮细胞损伤、遗传因素和营养因素等方面均可独立促进子痫前期的发生，滋养细胞侵入螺旋小动脉不全，子宫肌层螺旋小动脉未发生重铸，异常狭窄的螺旋动脉使得胎盘灌注减少和缺氧，最终导致子痫前期的发生[7]。另外，绒毛膜细胞间质的纤维化以及血管再生的障碍，均可影响到胎盘血管的痉挛，进而促进血压的波动或者收缩压的升高。美国国立卫生院在分析鼠成纤维细胞在高血流灌注下的生物学功能改变中发现，Gas6作为调节局部免疫反应、血管的再生以及炎症反应的重要介质，其对于下游信号通路acs-6/axl的激活以及Notch2/cyc/bcl调节，可以影响到血小板指数以及血小板活性达标率[8-9]，而Gas-6与络氨酸家族受体的结合，可进一步促进绒毛膜间质细胞的纤维化，并影响胎盘血流动力学的稳定。本次研究重在探讨Gas-6在子痫前期患者胎盘组织中的表达差异，进而揭示Gas-6在妊娠期高血压疾病中的生物学功能。

血小板、血清白蛋白、血肌酐以及动脉血压均为评估子痫前期患者病情程度的重要指标，子痫组和对照组患者动脉收缩压以及舒张压均明显升高，血小板相对降低，不足250×109/L，其中子痫组患者的收缩压可达160 mmHg以上，而舒张压可达100 mmHg以上，血小板的上升提示患者体内的凝血功能存在一定的激活与紊乱，血小板活性的升高可促进血栓性疾病的发生，加剧在收缩压大于160 mmHg情况下发生子痫的风险。通过免疫组化分析可见，在子痫孕产妇胎膜以及胎盘组织中，Gas-6的表达均明显增强，Gas-6的表达主要位于绒毛膜滋养细胞内，定位于细胞膜内侧，而细胞核周边以及细胞间质中的Gas-6表达降低。胎膜以及胎盘组织中的Gas-6蛋白水平的高表达提示其与妊娠期高血压或者子痫前期的发生有关，有研究表明在妊娠32～37周内发生子痫的孕产妇，其产后胎盘的免疫组化分析可见Gas-6表达阳性率达45%以上，明显高于未发生子痫的孕产妇[10-11]，同时在胎盘血管再生不良以及部位间质纤维化较为明显的孕产妇胎膜中，Gas-6的高表达与孕产妇体内血小板性血栓的形成以及粥样斑块的纤维化存在一定的关联[12]。同时，Gas6 mRNA的表达与蛋白水平的表达具有一致性，在转录调节因子FXN-2的调节下，Gas6 mRNA翻译表达为Gas6蛋白，其对于络氨酸末端的羟基化可促进胎膜或者胎盘组织的间质纤维化，并可抑制血管内皮生长因子VEGF-2的表达，进而导致胎盘血管的再生性障碍，提高血流灌注的不稳定性。Gas6 mRNA以及蛋白高表达的孕产妇，其体内D-二聚体相对较高，而血小板相对较低，特别是血小板可下降至150×109/L左右，而D-二聚体亦大于2.5 mg/L，提示纤溶亢进以及凝血机制的异常可能是加剧Gas6对子痫患者影响的重要因素之一。

子痫前期患者胎膜或者胎盘组织中的Gas6蛋白水平以及基因水平的高表达，与妊娠期高血压疾病的发生具有显著的关联，Gas6的升高可能通过调节胎盘血管的形成、促凝机制以及影响绒毛膜间质细胞的纤维化，进而影响子痫前期的发生发展。

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Expression of Gas6 in placenta or decidual tissue and its relationship with preeclampsia.

LI Qi-xia,HE Yu-lan,JIN Yu.Department of Obstetrics and Gynecology,the Fifth Affiliated Hospital of Southern Medical University,Guangzhou 510900,Guangdong,CHINA

Objective To investigate the expression of growth arrest specific protein 6(Gas6)in placenta or decidual tissue and its relationship with the pathogenesis of preeclampsia.MethodsFrom June 2012 to April 2015,42 pregnant women of severe preeclampsia undergoing cesarean delivery were selected as preeclampsia group,and 42 normal pregnant women undergoing cesarean section were chosen as the control group.Immunohistochemistry was used to detect the expression of Gas6 protein in placenta or decidual tissue,and reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to detect Gas6 mRNA expression in placental tissue.The relationships of Gas6 mRNA with severe preeclampsia related indicators were analyzed.ResultsThe systolic blood pressure,diastolic blood pressure,serum creatinine(Scr)in preeclampsia group were significantly higher than those in the control group,(163.2±16.4)mmHg vs (119.5±8.3)mmHg,(101.4±9.5)mmHg vs(71.6±8.3)mmHg,(60.4±13.2)μmol/L vs(41.0±11.9)μmol/L,P＜0.05.The levels of albumin,platelet in preeclampsia group were significantly lower than those in the control group,(30.4±3.9)g/L vs(35.1±4.2)g/L,(167.3±54.1)×109/L vs(256.0±83.7)×109/L,P＜0.05.The expression intensity of Gas6 protein in placenta or decidual tissue was significantly higher in preeclampsia group than control group(P＜0.05).The Gas6 mRNA expression level in placenta was significantly higher in preeclampsia group than control group of(0.61±0.23)vs(0.34± 0.18),P＜0.05.The expression levels of Gas6 mRNA in placenta in preeclampsia group showed a significant positive correlation with systolic blood pressure,diastolic blood pressure,Scr(r=0.417,0.382,0.405,P＜0.05),but a significant negative correlation with albumin,platelet levels(r=-0.326,-0.314,P＜0.05).ConclusionPreeclampsia or placental decidua tissue Gas6 expression and the pathogenesis of preeclampsia.

Placenta;Decidual tissue;Growth arrest specific protein 6;Preeclampsia;Correlation

R714.24+5

A

1003—6350（2016）09—1402—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.09.010

2016-01-06)

广州市医药卫生科技项目（编号：20141A041010）

李绮霞。E-mail：liqixia1979@sina.com