医用透明质酸钠修复贴的生物学试验

王宗尉　肖佳音　李庆忠

(黑龙江省食品药品检验检测所，黑龙江 哈尔滨 150001)



医用透明质酸钠修复贴的生物学试验

王宗尉肖佳音李庆忠

(黑龙江省食品药品检验检测所，黑龙江 哈尔滨 150001)

摘要目的观察医用透明质酸钠修复贴对实验动物的皮肤致敏反应、皮肤刺激反应和细胞毒性反应，为其作为医疗器械用途的生物安全性评价提供科学依据。方法根据该产品与人体接触方式及接触时间，按照医疗器械生物学评价标准选择皮肤致敏试验，皮肤刺激试验，细胞毒性试验进行生物安全性评价。结果未出现皮肤致敏反应及皮肤刺激反应，无细胞毒性。结论医用透明质酸钠修复贴临床用于缓解和补偿损伤使用是安全的。

关键词医用透明质酸钠修复贴；医疗器械；生物安全性评价

文章编码：1001-8131(2016)02-0142-02

透明质酸钠是一种天然直链大分子多糖，对其深加工后制成的医用透明质酸钠凝胶被广泛用于眼科手术，防治外伤性或退变性骨关节炎，外科手术等。由透明质酸钠加工制得的医用透明质酸钠修复贴作为一种新型生物材料，用于修复皮肤疤痕，临床对其安全评价未见报道。因此我们对其进行生物安全评价，现报告如下：

1资料与方法

1.1一般资料：①供试品：医用透明质酸钠修复贴，哈尔滨市天地仁医药科技有限公司，批号20130129，规格为5 cm×5 cm。②仪器设备：CO2培养箱(thermo electron corporation，3111)，倒置显微镜(重庆光电仪器总公司，XDS-1B)，电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，AL204)，家用微波炉(顺德惠而浦蚬华微波炉制品有限公司，KS2183)，电热恒温水浴锅(上海医疗器械三厂，H.H.S)，恒温培养箱(南京实验仪器厂，000984-09-0)，电热鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司，DGG-9240BD)，台式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司，TMQ.CV/5070)。

1.2主要试剂：RPMI.1640培养液(吉诺生物医药技术有限公司，批号：12081705)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批号：120509)，青-链霉素(gibco by life technologies，批号：1116255)，消化酶(吉诺生物医药技术有限公司，批号：12060701)，琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20080802)，中性红(天津市天新精细化工开发中心，批号：20050428)，PBS(吉诺生物医药技术有限公司，批号：12082903)，DPBS(M&C Gene Technology，批号：A0612110)，苯酚(天津市永大化学试剂有限公司，批号：20110326)，吸收性医用明胶海绵(金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂，批号：121004)。

1.3实验动物及细胞：健康、初成年的同一远交系雄性白化豚鼠15只，体重300～500g，由吉林市昌邑区左家实验动物养殖场提供，生产许可证：SCXK(吉)2009-0001。健康、初成年的同一品系雄性白化兔3只，体重分别为2.2 kg，2.3 kg和2.5 kg，由哈药集团中药二厂提供，生产许可证：SCXK(黑)2012-002。ATCC CCL1[NCTC clone 929(小鼠成纤维细胞)]由中科院提供。

1.4方法：按中华人民共和国国家标准进行试验[1-3]。

1.4.1 迟发型超敏反应封闭贴敷试验。①试验样品制备：试验样品：剪成2.5 cm×2.5 cm尺寸敷贴片，直接用于试验。阴性对照：将滤纸剪成2.5 cm×2.5 cm尺寸并用氯化钠注射液浸透，作为阴性对照样品敷贴片。②试验步骤：将15只豚鼠分为两组，其中试验样品组10只豚鼠，阴性对照组5只豚鼠。诱导阶段：将试验样品和阴性对照分别局部贴敷于豚鼠左上背部除毛部位，再用封闭性包扎带固定6 h，6 h后除去封闭包扎带和敷贴片。1周中连续3 d重复该步骤，连续3周。激发阶段：最后一次诱导贴敷后14 d，用试验样品对试验样品组和对照组全部豚鼠进行激发。将试验样品贴敷于每只豚鼠的右下腹侧去毛部位，6 h后除去固定器、封闭包扎带和敷贴片。

1.4.2皮肤刺激试验。①试验样品制备：同迟发型超敏反应封闭贴敷试验。②试验步骤：选择体重大于2 kg同一品系健康白化兔3只，于实验前24 h将家兔背部被毛除去(约10 cm×15 cm区域)，作为试验和观察部位。单次接触试验：在家兔背部左前侧和右后侧贴敷试验样品，在家兔背部右前侧和右后侧贴敷阴性对照，用纱布覆盖敷贴片部位，并用包扎带固定4 h。多次接触试验：单次接触试验完成72 h后进行，试验方法同单次接触试验，连续实验12d。

1.4.3细胞毒性试验(琼脂扩散法)。①试验样品制备：试验样品：将透明质酸钠修复贴制成直径约5 mm的圆片；阴性对照：将高密度聚乙烯制成直径约为5 mm，厚约2 mm的圆片；阳性对照：将医用明胶海绵制成直径约为5 mm的圆片，并用20%的苯酚溶液将其浸透。②试验步骤：选择复苏传至第4代的细胞再传代后培养48h，消化及稀释，使细胞浓度为3×105个/mL。取6个培养皿，每皿加10 mL细胞悬液，放入CO2培养箱37℃培养24 h。将制备好的2×琼脂加热融化后冷却到48 ℃，与预热至48 ℃的2×培养液以1∶1混匀后，倒入上述弃去原培养液的6个培养皿中，每皿10 mL。待琼脂培养基凝固后，每皿加入10 mL 0.01%中性红染色液并在暗处保存20 min。将制备好的样品放入培养皿中，供试品，阴性对照组和阳性对照组各为2皿，每皿放置2个样品，放入CO2培养箱37℃培养24 h。

2结果

2.1迟发型超敏反应封闭贴敷试验结果：根据Magnusson和Kligman分级，敷贴试验反应为无明显改变，为0级；散发性或斑点状红斑，为1级；中度融合性红斑，为2级；重度红斑和水肿，为3级。

除去激发敷贴片后48 h进行评分，试验样品组和阴性对照组豚鼠激发部位均无明显改变，根据上述分级标准，两组等级均为0级。

2.2皮肤刺激试验结果：根据皮肤反应积分系统，通过反应的红斑和结痂形成、水肿形成对原发性刺激计分，刺激最高计8分。

红斑和结痂形成为无红斑，计0分；极轻微红斑(勉强可见)，计1分；清晰红斑，计2分；中度红斑，计3分；重度红斑(紫红色)至焦痂形成，计4分。

水肿形成为无水肿，计0分；极轻微水肿(勉强可见)，计1分；清晰水肿(肿起，不超出区域边缘)，计2分；中度水肿(肿起约1 mm)，计3分；重度水肿(肿起超过1 mm，并超出接触区)，计4分。

单次接触试验后24 h、48 h、72 h，3只家兔皮肤反应均未出现红斑和水肿。多次接触试验每次在除去敷贴片后1 h以及再次接触前和末次接触后的1 h、24 h、48 h、72 h，3只家兔皮肤反应均未出现红斑和水肿。

2.3细胞毒性试验(琼脂扩散法)结果：根据褪色指数及溶解指数评判标准，利用显微镜观察褪色指数和溶解指数。

显微镜观察未发现褪色，褪色指数为0；只有试样下方褪色，褪色指数为1；褪色边缘距试样边缘小于 5.0 mm，褪色指数为2；褪色边缘距试样边缘在5～10.0 mm内，褪色指数为3；褪色边缘距试样边缘大于 10.0 mm，褪色指数为4；整个培养区褪色，褪色指数为5。

显微镜观察未发现细胞溶解，溶解指数为0；细胞溶解小于20%，溶解指数为1；细胞溶解在20%～40%内，溶解指数为2；细胞溶解在 40%～60%内，溶解指数为3；细胞溶解在60%～80%内，溶解指数为4；细胞溶解大于80%，溶解指数为5。

根据细胞毒性分级标准，细胞反应=褪色指数/溶解指数。细胞反应为0/0，0级，试验样品无细胞毒性；细胞反应为1/1，1级，试验样品有轻度细胞毒性；细胞反应为2/2至3/3，2级，试验样品有中度细胞毒性；细胞反应为4/4至5/5，3级，试验样品有重度细胞毒性。

供试品组四个敷贴片均未发现褪色，未发现细胞溶解，细胞反应为0/0，0级，无细胞毒性。阴性对照组四个敷贴片均未发现褪色，未发现细胞溶解，细胞反应为0/0，0级，无细胞毒性。阳性对照组四个敷贴片褪色边缘距试样边缘7 mm，细胞溶解为50%，细胞反应为3/3，0级，中度细胞毒性。

3讨论

透明质酸钠是透明质酸的钠盐形式，它具有保湿性、润滑性、生物相容性、生物可降解性、细胞流动性和细胞附着等功能[4]。对其深加工制成的医用透明质酸钠凝胶被广泛用于眼科手术，防治外伤性或退变性骨关节炎，外科手术等。医用透明质酸钠修复贴作为一种新型生物材料，在安全性评价方面未见报道，本试验通过皮肤致敏试验，皮肤刺激试验，细胞毒试验三种试验对其进行生物学评价，医用透明质酸钠修复贴作为医疗器械使用是安全的。

参考文献

[1]GB/T 16886.10-2005医疗器械生物学评价 第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验[S].

[2]GB/T 16886.5-2003医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验[S].

[3]GB/T 16886.2-2011医疗器械生物学评价 第2部分：动物福利要求[S].

[4]毕莹，何文龙，李杰新.医用透明质酸钠运动粘度的相关因素试验[J].青岛大学学报，2002，17(1)：1-4.

[中图分类号]R986

[文献标识码]A学科分类代码：35099

收稿日期：2015-08-07

Biological Tests of Medical Sodium Hyaluronate Repair Paste

Wang ZongweiXiao JiayinLi Qingzhong

(Heilongjiang Institute for Food and Drag Control，Harbin 150001，China)

AbstractObjectiveObserving medical sodium hyaluronate repair paste on experimental animal skin sensitization, skin irritation and cytotoxicity, providing scientific basis to evaluate the biological safety of medical uses as its. MethodsOn the basis of the product and the human body contact and contact time, according to the standards of biological evaluation of medical devices of skin sensitization test, skin irritation test, evaluate the bio safety of cell toxicity test.ResultsNo skin sensitization and skin irritation, no cell toxicity. Conclusionmedical sodium hyaluronate repair with clinical for mitigation and compensation injury is safe to use.

Key wordsMedical sodium hyaluronate repair paste；Medical apparatus；Biological safety evaluation