五种五指山野生灵芝培养基筛选及活性成分分析*

范平杰，袁学军，王亦我，王 丹

（海南热带海洋学院，热带生物与农学院，海南 三亚 572000）

五种五指山野生灵芝培养基筛选及活性成分分析*

范平杰，袁学军**，王亦我，王 丹

（海南热带海洋学院，热带生物与农学院，海南 三亚 572000）

以五指山野生灵芝1号、2号、3号、4号、5号和对照7号灵芝为材料，研究4种母种培养基配方和4种原种培养基配方对野生灵芝菌种菌丝生长速度和生长势的影响，并比较分析不同灵芝品种中灵芝蛋白、多糖、三萜的含量。结果显示，在4种母种培养基上，菌丝生长速度的差异极显著，生长速度最快和生长势最强的是培养基配方B（PDA＋木屑），最差的是配方D（PSA）；在4种原种培养基上，生长速度和生长势强弱的先后顺序为配方3＞配方4＞配方2＞配方1；在5种野生灵芝中，灵芝多糖、蛋白质、三萜含量最高的分别是5号（0.732 mg·g－1）、2号（0.088 mg·g－1）、5号（1.193 mg·g－1），3种成分综合含量最高的是5号。该试验为五指山野生灵芝的开发利用提供了参考依据。

野生灵芝；培养基筛选；活性成分

中国已知野生灵芝分4属3亚属103种。其中，海南灵芝分布的种类有72种，约占全国灵芝总种数的70%[1]。由于灵芝含有灵芝多糖、灵芝蛋白、灵芝三萜等多种药理活性物质，具有营养、保健、治疗疾病的作用[2]，因此，近年来灵芝的综合开发利用越来越受到重视，对以下野生灵芝培养基的筛选有过陆续的报道：海南尖峰岭的黄边灵芝（Ganoderma luteomarhinatum）和咖啡网孢芝（Humphreya coffea－tum）[3]、泰山赤灵 （G.lucidum）[4]、西藏野生灵芝（G.leucocontextus）[5]、野生灵芝（G.applanatum）[6]等；也有学者曾对3种[7]和6种[8]不同灵芝品种的活性成分进行了比较。不同学者对栽培与野生品种的活性成分进行分析比较，其结果显示差异显著，如桂西北野生灵芝和人工栽培灵芝[9]、海南栽培灵芝与野生灵芝等[10]。灵芝营养成分丰富且营养价值高，既可药用，也可用来加工成保健品，是比较理想的保健营养源。随着消费量的增长，种植面积不断扩大，但灵芝品种和培养基配方是影响灵芝产量和质量的主要因素[11-12]。据调查，五指山野生灵芝有20多个品种。本试验使用的材料为具有代表性的5种五指山野生灵芝，设计多个母种和原种配方，并对活性成分进行比较分析，筛选出最佳品种和最佳培养基配方，为有效地开发利用五指山野生灵芝资源奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织分离材料

本文所用五指山野生灵芝1号、2号、3号、4号、5号，其形态特征见图1。

图1 本文使用的五指山野生灵芝Fig.1 Wild Ganoderma lucidum in Wuzhi Mountain in this paper

1.1.2 培养基材料

木屑、棉籽壳、麦麸、马铃薯、葡萄糖、蔗糖、琼脂、石膏。

1.1.3 药品材料

葡萄糖、熊果酸、和香草醛、牛白蛋白、考马斯亮蓝G250均为化学纯；高氯酸、硫酸、蒽酮、无水乙醇、盐酸、碳酸氢钠、氢氧化钠、三氯甲烷、磷酸、冰乙酸、氯化钠、硫酸铵均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 野生灵芝组织分离

选取健壮的幼灵芝（6分成熟），在接种箱内先将种菇表面用75%的酒精擦拭，然后纵切，在菌盖与菌柄交界处切成长0.5 cm×0.5 cm的小块，接种到PDA培养基斜面的中央，塞好棉塞，在25℃培养条件下于第11天挑选边缘健壮菌丝进行转接扩繁。

1.2.2 培养基配方

（1）母种培养基配方

配方A（PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，水1 000 mL；配方B：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、木屑40 g（水煮15 min取过滤液），水1 000 mL；配方C：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、MgSO41.5 g、KH2PO43 g，水1 000 mL；配方D（PSA）：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g，水1 000 mL。

（2）原种培养基配方

配方1（木屑培养基）：木屑990 g、石膏10 g，水1 300 mL；配方2（木屑麦麸培养基）：木屑790 g、麦麸200 g、石膏10 g，水1 200 mL；配方3（棉籽壳培养基）：棉籽壳990 g、石膏10 g，水1 200 mL；配方4（棉籽壳麦麸培养基）：棉籽壳790 g、麦麸200 g、石膏10 g，水1 300 mL。

1.2.3 培养基的制作与培养

母种按PDA平板培养基的方法制作，培养基灭菌之前pH调整为6.5，在121℃的条件下灭菌20 min～30 min，每个处理10个重复，总共4个处理。

原种按常规方法制作，培养基的pH调整为6.5，瓶装，121℃灭菌2 h，每个处理10个重复，总共4个处理。培养的条件为：黑暗，室温（25±1）℃左右，湿度60%～65%。

1.2.4 测量和观察指标

分别第7天和第14天时测量母种和原种菌丝的生长速度和观察生长势，菌丝的生长势分为强、中、弱。原种第12天时测量菌丝的生长速度，并观察菌丝生长势（强、中、弱）。

1.2.5 活性成分含量测定

灵芝多糖测定的标准曲线为：y=0.7622x+0.0122, R2=0.998，参照考蒽酮-硫酸法[13]；灵芝蛋白测定的标准曲线为：y=0.6643x+0.0009，R2=0.999，参照考马斯亮蓝G-250法[13]；灵芝三萜测定的标准曲线为：y=0.4144x-0.01，R2=0.9934，参照光度测定法[13]。

1.2.6 统计分析

用Stst软件（王韶华教授发明）进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同培养基配方对母种生长的影响

不同培养基配方对母种菌丝生长速度和生长势的影响，见表1和表2。

表1 不同配方对母种菌丝生长速度的影响Tab.1 Effects of different formulas on the growth rate of mother mycelium

表2 不同培养基配方对母种菌丝生长势的影响Tab.2 Effects of different formulas on the growth potential of mother mycelium

结果显示，4种培养基间菌丝的生长速度差异显著，在培养基配方B上，5种灵芝菌丝生长速度均最快，最快速度达到1.24 cm·d-1；其次是配方A和配方C；最差的培养基配方为D。生长势最强的培养基配方为B；其次是配方A和配方C；最差的是配方D。可能是由于葡萄糖可以被菌丝直接吸收，而蔗糖降解为葡萄糖才能被吸收；灵芝属于木腐型真菌，木屑水煮液中增加了木屑中的营养成分，因此，在含有木屑水煮培养基上生长速度均最快，生长势最强。

2.2 不同培养基配方对原种生长的影响

不同培养基配方对原种菌丝生长速度和生长势的影响见表3和表4。

所有灵芝品种的菌丝在培养基配方3上生长速度均最快，最快速度达0.875 cm·d-1；其次是配方4、配方2；配方1效果最差。菌丝生长的最适C:N为（30～40）∶1。比值过大，营养缺乏，菌丝生长不良，且速度慢；比值过小，营养过于丰富，反而不适于菌丝生长。因此，棉籽壳培养基配方3最适宜原种菌丝生长，且生长势最强。

表3 不同配方对原种菌丝生长速度的影响Tab.3 Effects of different formulas on the growth rate of different protospecies mycelium

表4 不同灵芝品种对原种菌丝生长势的影响Tab.4 Effect of different formulas on the growth potential of different protospecies mycelium

2.3 不同品种灵芝活性成分比较

不同品种灵芝活性成分比较情况见表5。

多糖含量除灵芝1号和5号间无差异外，其他品种之间均存在极显著差异：对照最高（0.826 mg· mL-1），其次是灵芝1号和5号，最差是灵芝2号（0.336 mg·mL-1）。灵芝蛋白质含量方面：2号最高（0.088 mg·mL-1），依次是7号、5号、3号、4号，最差的是1号（0.012 mg·mL-1）；灵芝三萜含量方面：5号最高（1.193 mg·mL-1），1号最低（0.352 mg·mL-1），由高到低的顺序是5号、4号、7号、3号、2号、1号。根据3种活性成分的含量综合评价，灵芝5号和7号最佳。

3 结论

本试验中，灵芝菌丝在PDA+木屑培养基配方（配方B）上生长最佳，可能是由于灵芝属为木腐型真菌，在PDA培养基中加入木屑过滤液，可提供木质中的营养。原种最佳培养基均为棉籽壳配方（配方3），可能由于棉籽壳中的C∶N为 (15～20)∶1，更适合菌丝生长，营养不足或过剩使菌丝生长均不良。

灵芝1号和5号多糖含量最高，灵芝2号蛋白质含量最高，灵芝5号三萜含量最高。根据3种活性成分的含量综合评价，灵芝5号最佳。

表5 不同灵芝活性成分含量比较Tab.5 Comparison of the active components of different kinds of Ganoderma lucidum

[1]赵继鼎.中国灵芝新编[M].北京：科学出版社，1989.

[2]贾定文，郑林用.灵芝属真菌分类研究现状及分析[J].西南农业学报，2003，16（增刊）：64-68.

[3]陈友，胡佳娟，陈忠荫，等.海南野生灵芝培养基配方优化[J].琼州学院学报，2013，20（2）：33-35.

[4]芦站根.泰山赤灵芝母种培养基筛选研究[J].江苏农业科学，2009（5）：196-197.

[5]张君丽.西藏野生灵芝菌种掊养基筛选试验[J].西藏农业科技，2015，37（1）：15-17.

[6]袁学军，李艳丽，陈永敢，等.野生灵芝菌种培养基筛选的研究[J].中国食用菌，2012，31（4）：24-26.

[7]张舒峰，马天宇，韩春姬.3种不同来源灵芝活性成分比较及提取工艺优[J].延边大学农学学报，2014，36（4）：336-341.

[8]赵思佳，陈曦，陈苹.中国6大人工栽培灵芝产地种植的灵芝综合质量比较//2011国际灵芝研究学术会议论文集[C].北京：国际灵芝研究学会，2011：96.

[9]叶美凤，覃勇荣，刘旭辉，等.桂西北野生灵芝和人工栽培灵芝多糖含量比较[J].北方园艺，2010（14）：186-188.

[10]莫峥嵘，陈光英，兰云，等.海南栽培灵芝与野生灵芝的总三萜酸含量比较[J].食品科技，2012，37（3）：83-84.

[11]蒋冬花.培养基配方与栽培方式对灵芝产量和质量和影响[J].海南大学学报：自然科学版，2001，19（1）：76-79.

[12]Roberta S,Paola C.Biochemical characterisation and antioxidant activity of mycelium of Ganoderma lucidum from Central Italy[J].Food Chemistry,2009,116（1）:145.

[13]袁学军，陈永敢，陈光宙，等.不同栽培方式对灵芝活性成分的影响[J].中国食用菌，2012，31（5）：18-19.

Culture Medium Screening and Active Component Analysis of Five Wild Ganoderma lucidum in Wuzhi Mountain

FAN Ping-jie,YUAN Xue-jun,WANG Yi-wo,WANG Dan
(College of Tropical Biology and Agriculture,Hainan Tropical Ocean College,Sanya 572000,China)

In this experiment,taking wild Ganoderma lucidum No.1,No.2,No.3,No.4,No.5 and control No.7 from Wuzhi Mountain as materials,the four kinds of mother culture medium and four kinds of protospecies culture medium were designed based on mycelium growth rate and growth vigor of wild strains,and a comparative analysis on the content of protein,polysaccharide,triterpene were studied.The results showed that in four kinds of mother culture medium,mycelium growth rate were significantly difference,the fastest growth rate and the strongest growth vigor was in formula B,and the worst was in formula D.The order of growth rate and growth potential on four kinds of protospecies culture medium were formula three＞formula four＞formula two＞formula one.The highest levels of the proteins,polysaccharides and triterpenes were in No.5（0.732 mg·g－1）,No.2（0.088 mg·g－1）,No.5（1.193 mg·g－1）respectively,and three comprehensive content of No.5 was the highest.This experiment provided reference for the development and utilization of wild G.lucidum in Wuzhi Mountain.

wild Ganoderma lucidum;culture medium screening;active ingredient

S646.9

A

1003-8310（2016）05-0024-04

10.13629/j.cnki.53－1054.2016.05.007

海南省高校重点科研项目（Hnky2015ZD－15）；三亚重点实验室项目（L1210）；大学生创业项目（2015111000006、20150114）。

范平杰（1987－），男，本科，助教，主要从事植物学、菌物学及植物保护研究。E－mail:33286042＠qq.com

**通信作者：袁学军（1967－），男，博士，教授，主要从事菌物学、组织培养和遗传转化研究。E－mail:yuanxuej＠163.com

2016－06－01