新型血红蛋白携氧载体OC33抗猪重度失血性休克的有效性研究

臧家涛，李　涛，田昆仑，朱　娱，蓝　丹，彭小勇，刘良明



·论著·

新型血红蛋白携氧载体OC33抗猪重度失血性休克的有效性研究

臧家涛，李涛，田昆仑，朱娱，蓝丹，彭小勇，刘良明

【摘要】目的明确新型血红蛋白携氧载体OC33是否具有抗猪重度失血性休克的作用。 方法无特定病原(specified-pathogens free, SPF)级小香猪，雌雄各半，8～10月龄，体重25～30kg。制备50%失血量重度失血性休克猪模型，随机分为乳酸林格式液组(LR)，全血组(WB)，OC33低、中、高剂量组(0.1g Hb/kg、0.3g Hb/kg、0.5g Hb/kg)进行治疗，每组6只。测定组织氧供(DO2)、氧耗(VO2)、血流动力学、心肌力学、心输出量及心功能等指标，记录24h存活率与存活时间，进行统计学处理以明确OC33是否具有抗猪重度失血性休克的作用。结果各剂量OC33组模型动物氧供、氧耗、血流动力学、心输出量、心肌力学指标(MAP、LVSP、LVEDP、+/-dp/dtmax)、心功能(CO、CI、SI)、存活时间与存活率等指标均优于LR组，其中0.5g Hb/kg组效果接近WB组。结论OC33具有较好的抗猪重度失血性休克的效果。

【关键词】失血性休克； 携氧载体； 红细胞； 血红蛋白； 动物模型

作者单位： 400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所第二研究室

基于血红蛋白的携氧载体(hemoglobin based oxygen carriers,HBOCs)具有与红细胞相近的携氧性质，没有传统输血方式面临的血型复杂、输血感染、储存期短、血源枯竭等问题，近几十年来一直是众多科研工作者的研究目标，可用于战场和院前急救，特殊情况下代替红细胞，改善血管栓塞患者重要器官缺氧，肿瘤治疗等领域[1-3]。前期研制的HBOCs产品可分为二代，其中第一代HBOC产品导致急性肾功能衰竭、死亡率升高等严重不良反应，很快被淘汰；第二代HBOC产品在技术工艺、理论方法等方面有显著进步，多种产品进入Ⅲ期临床阶段，其作为红细胞代用品的有效性得到证实，但仍存在一定的心肌梗死、血压升高等心血管系统不良反应，最终未能正式获准进入临床应用[4]。目前，科研工作者们正在研究新的技术方法，包括提高血红蛋白(hemoglobin,Hb)纯度的方法，更理想的Hb分子内及分子间交联的方法，控制Hb氧化损伤的方法等[5-7]，争取早日开发出效果更好、毒性更低、临床可用的第三代HBOC产品。

香港新意康生物科技有限公司近年来一直致力于新一代HBOC的开发，经过多次工艺改进开发出了代号为OC33的产品。OC33是由牛Hb αβ二聚体经双阿司匹林分子内交联制备成分子量64千道尔顿(kDa)的Hb(αβ)2四聚体，再加入抗氧化剂、稳定剂、缓冲盐等制成。本实验室前期受新意康生物科技有限公司委托，通过重度失血性休克模型大鼠对OC33进行了初步评价，结果显示OC33具有较好的抗大鼠重度失血性休克的效果。为进一步明确OC33的抗休克作用，有必要利用重度失血性休克大动物模型进行进一步实验，以全面评价OC33作为新一代HBOC在抗重度失血性休克方面的效果。为此，本研究选取小型猪作为实验动物制备重度失血性休克模型，重点评估OC33改善缺氧状态、恢复心血管系统功能、提高存活率等方面的有效性，为后期进一步研究提供理论依据。

材料与方法

1主要仪器与试剂

OC33由香港新意康生物科技有限公司提供，Hb浓度6～7g/dL，含N-乙酰半胱氨酸、Ringer’s醋酸盐及K+、Na+、Cl-，渗透压约300mOsm。

乳酸林格氏液(四平巨能药业有限公司)；肝素钠生理盐水(江苏万邦生化医药股份有限公司)；戊巴比妥钠(北京化学试剂公司)；注射用青霉素钠、注射用硫酸链霉素(华北制药股份有限公司)；全血，失血性休克模型小型猪自体。

血流动力学测定仪、心输血量测定仪(Power Lab，澳大利亚)，PF5010激光多谱勒组织血流量测定仪(Perimed，瑞士)，MVIS-2020血液流变学测定仪(重庆天海医疗设备公司)，Phox plusl血气分析仪(Nova，美国)，微量注射式输液泵(B.Braun, 德国)。

2动物模型[7]

无特定病原(specified-pathogens free, SPF)级小香猪，第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供，雌雄各半，8～10月龄，体重25～30kg。实验前1d禁食，自由饮水。实验当日先用氯胺酮诱导麻醉，再腹腔注射质量体积比(m/V)3%戊巴比妥钠溶液麻醉。右侧股动脉、股静脉插管，插管完成后经股脉注射500U/kg肝素钠生理盐水抗凝；股动脉插管经三通管连接水银血压计，供观测血压和放血，股静脉插管用于给药。按55mL/kg计算猪全血量(whole blood,WB)，各组以约6mL/(kg·min)的速度按照50%失血量进行放血。放血完毕，用输液泵先输注等失血量体积乳酸林格氏液(Ringer’s solution，LR)，然后按实验分组分别输注LR、WB和OC33进行复苏。复苏、测试完毕，拔出股动、静脉插管并进行结扎，缝合伤口后给予注射用青霉素钠7×104U/kg，注射用硫酸链霉素1×105U/kg。治疗结束，将动物送回实验动物中心，限量饮食，自由饮水。实验完成，存活的猪在麻醉状态下，通过静脉快速注射10%的氯化钾溶液(0.3～0.5mL/kg)处死。

3实验分组

30只小香猪根据体重分批次进行实验，使同批次动物体重差别<1kg；每批次动物随机分配至表1所示的分组，雌雄各半，每组6只。

表1　实验动物分组(每组6只)

模型制备完成，所有模型动物先通过注射泵输注等失血量体积LR，然后各组按照表1所示剂量通过右股静脉给药，各组自放血完毕至治疗完毕所输液体总体积为2倍失血量体积，OC33各剂量组给药体积与失血量体积相比较不足的部分用LR补足；LR、WB、OC33输注速度分别为250、200、50mL/h。治疗完毕观察24h存活率、存活时间。

4指标测量

另取40只小香猪按表1的方法分组，按上述相同方法进行模型制备，按上述方法治疗，在模型制备前后，药物治疗0.5、1、2、3h等6个时相点进行指标测定：通过股动脉插管连接的水银血压计测定平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)；1分钟计数法记录呼吸频率(respiration rate,RR)；右颈总动脉插管至左心室，连接血流动力学测定仪测定心率(heart rate,HR)、左室收缩峰压(left ventricular systolic pressure,LVSP)、等容收缩期左心室内压力最大上升/下降速率(the maximum rate of left ventricular pressure rise/drop,±dp/dtmax)；左股静脉插飘浮导管，连接心输血量测定仪测定心输出量，计算心排量(cardiac output,CO)、心脏指数(cardiac index,CI)、每搏量指数(stroke index,SI)等心功能指标及组织氧供(oxygen delivery,DO2)、氧耗(oxygen uptake,VO2)。

5数据分析

用SPSS 10.0统计分析软件进行数据处理，组间采用单因素或双因素方差分析，方差分析有统计学意义的组间比较采用q检验(P<0.05为差异显著；P<0.01为差异极显著)。

结果

1OC33复苏对重度失血性休克猪RR、MAP、HR的影响

休克后各组RR值均增加，复苏后有所降低(图1a)，与Ⅳ组比较差异不显著。休克后各组MAP均显著降低，复苏后MAP均不同程度升高；与Ⅳ组比较，各剂量组OC33都能显著升高MAP，而Ⅰ组甚至高于Ⅴ组(图1b)，显示OC33具有较显著的升高血压的作用。休克和复苏后各组猪的HR变化不明显，同一时相点HBOC各组与全血组比较总体无统计学差异(图1c)，表明OC33对心脏节律没有明显影响。

2OC33复苏对重度失血性休克猪心肌力学的影响

Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅴ组实验动物复苏后LVSP值快速显著升高，2、3h时相点LVSP值与Ⅳ组比较差异显著，Ⅲ组动物LVSP有轻度升高但无显著差异；Ⅰ组、Ⅱ组实验动物复苏后LVSP值略高于Ⅴ组(图2a)，表明OC33可快速改善心脏功能，提高左室收缩压力。与Ⅳ组相比，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组动物复苏后±dp/dtmax值均有所升高，其中I组给药后各时相点±dp/dtmax值显著升高(图2b、c)，表明0.5g Hb/kg OC33对重度失血性休克猪心肌收缩有明显改善作用。

3OC33复苏对重度失血性休克猪心功能的影响

与Ⅳ组相比，复苏后Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组动物的心功能指标CO、CI、SI均不同程度升高，其中Ⅰ组升高最显著且与Ⅴ组接近(图3)，表明OC33对重度失血性休克猪心功能有明显的恢复作用。

4OC33复苏对重度失血性休克猪氧供、氧耗影响

与Ⅳ组相比，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组动物复苏后DO2、VO2均不同程度增加，其中Ⅰ组变化最显著(图4)，表明OC33能够增加组织氧的供应，恢复缺血组织、细胞代谢水平。

5OC33复苏对重度失血性休克猪存活率、存活时间的影响

Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组模型动物24h存活率、存活时间均高于Ⅳ组，其中Ⅰ组数据接近Ⅴ组，显示OC33较LR疗效更好，与全血接近(表2)。

abc

与Ⅳ组比较：*P<0.05，**P<0.01

图1OC33对重度失血性休克猪RR、MAP、HR的影响

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与Ⅳ组比较：*P<0.05，**P<0.01

图2OC33对重度失血性休克猪心肌力学的影响

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与Ⅳ组比较：*P<0.05，**P<0.01

图3OC33对重度失血性休克猪心功能的影响

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与Ⅳ组比较：*P<0.05，**P<0.01

与Ⅳ组比较：*P<0.05，**P<0.01

讨论

当前临床常用的重度失血性休克早期急救复苏液体是乳酸林格氏液，其疗效较差，因此血液代用品的研究意义重大。理想的血液代用品应是兼具红细胞、血小板、白蛋白功能的等张等渗溶液，但受理论、技术条件的限制，在相当长的时间内人类将只能先行研制具备血液最重要的氧气运输功能的血液代用品——红细胞代用品，而通过对比既有红细胞代用品全氟碳与HBOC的实验室和临床数据，HBOC更有前景[8-9]。截止目前为止，已经开发了两代HBOC产品，其中多种第二代HBOC产品进入III期临床实验阶段，还曾经在艾滋病问题严重的非洲地区作为手术用血，已经非常接近正式临床应用[10]。当前HBOC研究领域面临的主要问题是减轻或消除其不良反应，尤其是对心血管系统的不良反应[11]。目前已经有研究者提出了一些针对血红蛋白氧化活性、NO消耗问题的技术方案，在实验室研究阶段取得了一些初步的成果[12]，香港新意康生物科技有限公司也研制了新型HBOC产品-OC33。相信在众多科研工作者的不懈努力下， HBOC正式进入临床应用的时刻将很快到来。

本研究在前期小动物模型试验基础上，实验用小香猪作为大动物模型，对香港新意康生物科技有限公司研制的OC33治疗重度失血性休克的有效性进行进一步研究。研究结果表明，OC33能有效升高重度失血性休克猪的血压，降低呼吸频率和心率，提高存活率并延长存活时间，这些大体指标的改善证实了OC33治疗重度失血性休克的有效性，其0.5g Hb/kg剂量的疗效接近甚至在某些指标上超过全血。OC33对于心功能、心肌力学、组织氧供和氧耗等参数的改善提示其能迅速发挥携氧、扩容的作用，防止重要脏器由于血容量降低、红细胞丢失发生缺血、缺氧，这也是其效果优于目前临床常用的乳酸林格氏液的主要原因。至于OC33是否有效地降低或避免了毒副作用，还需要通过急性、慢性毒性实验进一步研究。

参考文献：

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·临床问答·

问题1： 什么是肘关节“恐怖三联征”以及治疗原则？

解答：肘关节恐怖三联征(terrible triad of the elbow)是指肘关节后脱位同时伴有桡骨头和尺骨冠突骨折，常发生于高能量损伤。1996年由Hotchkiss首先将此种损伤独立提出并命名。治疗原则：肘关节恐怖三联征严重破坏肘关节的稳定性，非手术治疗效果差，治疗原则是首选手术治疗，使用钢板和(或)螺钉内固定结合铰链式外固定架治疗，可以取得较为良好的效果。治疗中注意观察上臂及肘部有无神经血管损伤，尤其是注意观察和处理骨筋膜室综合征。

(李继庆解放军477医院骨科，湖北 襄阳410210)

【DOI】 10.3969/j.issn.1009-4237.2016.02.009

Effect of a new hemoglobin based oxygen carrier OC33 in severe hemorrhagic shock of pigs

ZANGJia-tao,LITao,TIANKun-lun,ZHUYu,LANDan,PENGXiao-yong,LIULiang-ming

(Department 2,Institute of Surgery Research,Daping Hospital，Third Military Medical University，Chongqing400042,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of the hemoglobin based oxygen carrier,OC33,in severe hemorrhagic shock in pig models. MethodsEighteen severe hemorrhagic shock pig models (9 male pigs and 9 females pigs of 8-10 years weighted from 25-30kg) were prepared from specified pathogens free (SPF) pigs by controlled blood depleting of 50% whole blood volume. And then model pigs were randomly divided into three groups,Ringer’s solution team (LR),whole blood group (WB) and OC33 group. Model pigs were treated with corresponding solutions,and indexes including tissue oxygen delivery (DO2) and uptake (VO2),blood kinetics and myocardial kinetics,cardiac output and cardiac function were tested. Model pigs were sent back to observation ward after remedy and 24 hour survival time and survival rate were recorded. Statistical analysis was done to evaluate whether OC33 could be used in severe hemorrhagic shock pig remedy. ResultsIndexes including DO2,VO2,blood kinetics,heart output,myocardial mechanic parameters(MAP，LVSP，LVEDP，+/-dp/dtmax ),heart function parameters(CO，CI，SI),survival rate and time of the OC33 group were better than those in the LR group. The 0.5g Hb/kg group had the best effect among the three OC33 groups,some indexes of this group were even similar with those of the WB group. ConclusionOC33 is a good candidate in severe hemorrhagic shock remedy for pig models.

【Key words】hemorrhagic shock; oxygen carrier; red blood cell; hemoglobin; animal model

(收稿日期：2015-07-13； 修回日期： 2015-09-07)

通讯作者：刘良明，E-mail:liangmingliu@yahoo.com

【中图分类号】Q513; Q939.48; R394-33

【文献标识码】A

文章编号：1009-4237(2016)02-0094-04