顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法鉴别产紫杉醇的内生菌株J11和诱变菌株J11-8

戴黄益，刘明志，吕镇城

（1.西南林业大学生命科学学院云南昆明 650224；2.惠州学院生命科学学院，广东惠州 516007）

顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法鉴别产紫杉醇的内生菌株J11和诱变菌株J11-8

戴黄益1，2，刘明志2*，吕镇城2

（1.西南林业大学生命科学学院云南昆明 650224；2.惠州学院生命科学学院，广东惠州 516007）

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（HS-SPME-GC-MS）对产紫杉醇内生真菌J11及其诱变菌株J11-8的挥发性成分进行分析.结果表明，J11菌株可鉴定19种挥发性成分，J11-8菌株鉴定可鉴定24种挥发性成分，两者挥发性化学成分及相对百分含量具有明显差异.因此，HS-SPME-GC-MS可用于区分野生型真菌和突变真菌在代谢组学上的差异，在真菌的种属鉴定上具有重要的理论和实践价值.

内生真菌；紫杉醇；顶空固相微萃取（HS-SPME）；气相色谱-质谱（GC-MS）

目前，随着研究的深入，在地球上新发现的真菌的种类比预想的要多得多，其中，新发现的内生真菌的种类占据相当大的比例.传统的真菌的分类鉴定方法主要基于形态学的观察和鉴定，形态学鉴定的主要依赖于无性孢子和有性孢子，特别是有性孢子及其生殖过程.对于内生真菌来说，在很多情况下，无性孢子和有性孢子的形成需要与植物形成共生关系，这给鉴定工作造成了困难.目前，基于标准化和自动化程度较高的真菌鉴定方法逐步建立，如Biolog微生物自动分析系统［1］和BIOFOSUN系统鉴定［2］方法，但是，这两种真菌鉴定方法操作复杂，应用范围有限，且需要专用的仪器设备，因而，难于推广应用.另一方面，基于DNA条形码的分子生物学技术逐渐成熟，如ITS（Internal transcribed spacer）等条形码技术成为鉴定真菌的可靠方法［3-5］.目前，在GeneBank和EMBL数据库登记的真菌条形码序列呈现出快速增长，在真菌的鉴定中发挥了重要作用，成为真菌分子鉴定的主要方法.

随着现代高精度分析化学技术的不断发展和完善，在生物学领域展示了越来越广的应用前景.基于代谢组学基础上的对真菌的蛋白质，次生代谢产物和挥发性物质的微生物菌种鉴定方法成为可能，如基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）［6-9］，气相色谱-质谱（GC-MS）［10，11］.在本研究中，笔者分离获得一株产紫杉醇内生真菌J11［12，13］并通过诱变育种，获得产紫杉醇的高产菌株J11-8［14］.本文通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术分析鉴定了挥发性成分，结果表明，两个菌株的挥发性组及相对含量具有显著差异，这些结果可作为识别两个菌株“身份”的“指纹图谱”.该方法在真菌的菌种鉴定上可能具有应用前景.

1 材料与方法

1.1 材料

产紫杉醇的内生真菌J11菌株由本实验室分离获得，经形态和分子鉴定为葡萄座腔菌属真菌［11，12］.J11-8菌株为J11菌株的突变株，紫杉醇产量可达1024.2μg/L［13］.

QP-2010-Plus型气质联用仪（日本岛津公司）；手动顶空固相微萃取装置（德国IKA公司）；65 μm PDMS/ DVB统领取纤维头（美国Supelco公司）；Rtx-5MS色谱柱（美国安捷伦公司）.

1.2 HS-SPME法

J11和J11-8菌株培养于含PDA固体培养基的100 mL顶空瓶中15 d，用于固相微萃取.使用手动固相微萃取进样器及萃取头进行吸附.萃取头在使用前在气相色谱进样口老化2 h，老化温度为250℃.将老化的萃取头插入样品瓶的顶空部分，室温下吸附30 min.吸附完成后插入GC样口进行解吸附.

1.3 GC-MS分析条件

升温程序如下：起始温度40℃，保留2 min，以4℃/min升温到220℃，再以15℃/min升温到250℃，保留2 min.进样口温度250℃，连接口温度280℃，解吸附5 min.载气为高浓度He（99.99%），不分流进样，流速为1 mL/min.质谱条件：连接口温度280℃，电离方式EI，离子源温度为230℃，四级杆温度150℃；电子能量70 eV，Scan模式全程扫描.样品经过气相色谱进样分离后，形成不同色谱峰.

2 结果与分析

采用GC-MS计算机联用仪分析J11菌株和J11-8菌株的化学组成，经NIST/WILEY检索及面积归一化计算，分别确定2个菌株的挥发性化学组分.J11菌株的GC-MS总离子流图见图1，挥发性化学组分见表1，J11-8菌株的总离子流图见图2，挥发性化学组分见表2.

图1 J11菌株的GS-MS分析挥发性化学成分的总离子流图

表1 J11检测结果

图2 J11-8菌株的GC-MS分析挥发性化学成分的部离子流图

表2 J11-8

通过比较表1和表2，发现在野生型J11菌株的19个挥发性化学组分与其突变株J11-8的24个挥发性化学组分中，仅有3个组分相同，即二甲基硅烷二醇，柠檬油精和十二甲基环己硅氧烷，且其相对含量差异较大.在野生型菌株J11中，主要挥发性化学成分除了二甲基硅烷二醇（6.24%），柠檬油精（9.46）和十二甲基环己硅氧烷（31.26%）外，还包括十四甲基环庚硅氧烷（20.84%），十六甲基环辛硅氧烷（12.87%）以及对-乙酰基-邻-［（三甲基硅烷基）乙炔基］苯酚（9.73%），但在突变菌株中，除了二甲基硅烷二醇（19.71%）含量显著增加外，柠檬油精（1.33%）和十二甲基环己硅氧烷（0.60%）的含量显著降低，但是，乙醇（22.37%）和丙烷（13.78%）显著升高，此外，碳酸氢铵，氨基甲酸铵，1-碘-3-甲基-2-戊酮，三甲基丁醇等组分也显著升高.

3 讨论

通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法分析野生型J11菌株和突变菌株J11-8的挥发性化学成分，可以看出两者具有显著差异，这说明野生型菌株和突变型菌株在代谢途径上具有明显不同的特性，可用于区分野生型和突变型菌株，是菌种或菌株“亚型”的“身份标签”和“指纹图谱”.另一方面，从实验结果来看，由于野生型菌株和突变菌株在代谢组学上的差异程度显然超过了DNA序列的差异程度，因而，该方法是否可用于真菌的菌种鉴定一直存在疑问.事实上，同一个菌株在不同培养基，不同培养条件以及不同的培养时间，通过该方法分析获得的代谢“指纹图谱”也可能存在显著差异.因此，目前，在通过与DNA条形码序列比较，获得大量详实和可靠的数据，以及在提出一个标准化方案以前，通过该方法鉴定菌株可能是一个有争议的问题.虽然如此，该方法作为鉴别野生型菌株和突变型菌株的“指纹图谱”还是可靠的.

相对于同时蒸馏萃取（SDE-GC-MS），HS-SPMEGC-MS操作更简单.同时，相对于DNA条形码ITS所进行的菌种鉴定，利用HS-SPME-GC-MS进行菌种鉴定，节省了大量的操作步骤，且操作简单.如果能够与ITS等条形码比较，证明HS-SPME-GC-MS在鉴定菌种具有可靠性，以及建立标准化的方法，利用HS-SPMEGC-MS鉴定菌种为时不远，应该具有广阔的应用前景.目前，利用MALDI-TOF-MS鉴定真菌有较多研究报道［15，16］，但是，该方法需要提取真菌的全部蛋白质，蛋白质是否提取完全，以及蛋白质提取方法等将影响鉴定结果的准确性.从本实验的结果来看，通过HSSPME-GC-MS所获得的真菌挥发性化学组分较少，这将是影响其在基础研究和应用前景方面的主要障碍.因此，通过分析GC-MS分析真菌提取物中的小分子天然化合物有助于鉴别和鉴定真菌.

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【责任编辑：吴跃新】

Identification of Paclitaxel-producing Wild-type Entophyte fungus J11 and Its Mutant Strain J11-8 by HS-SPME-GC-MS

DAI Huang-yi1，2，LIU Ming-zhi2*，LV Zhen-cheng2

（1.College of Life Science，Southwest Forestry University，Kunming 650224，Yunnan China；2.School of Life Science，Huizhou University，Huizhou 516007，Guangdong China）

The volatile components of paclitaxel-producing wild-type endophyte fungus J11 and its mutant strain J11-8 were analyzed by headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry（HS-SPME-GC-MS）.Results showed that nineteen compounds in the J11 and twenty-four compounds in J11-8 were identified.The volatile components and their relative percentages in both strains had significant differences.The difference on metabolomics for wild-type fungus and mutant fungus could be distinguished by HS-SPME-GC-MS.The HS-SPME-GC-MS has an important theoretical and practical values on identification for fungus’s species and genus.

endophytic fungus；paclitaxel；headspace-solid-phase microextraction（HS-SPME）；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

R965.1

A

1671-5934（2016）06-0045-05

2016-10-15

广东省科技计划项目（2013B060400026）

戴黄益（1991-），女，广东龙川人，硕士研究生，研究方向为分子细胞生物学.

＊通讯作者：刘明志，教授，Email：tlmz63@163.com.