薯蓣皂苷对大鼠心肌收缩力影响的研究

韩　钰，杨　帆，丛恬駪，孙　凯，李　燕，康　毅，尹永强，娄建石

(天津医科大学基础医学院药理学教研室，天津　300070)



薯蓣皂苷对大鼠心肌收缩力影响的研究

韩钰，杨帆，丛恬駪，孙凯，李燕，康毅，尹永强，娄建石

(天津医科大学基础医学院药理学教研室，天津300070)

中国图书分类号：R-332；R284.1；R322.11；R331.31

摘要：目的观察薯蓣皂苷(dioscin，Dio)对大鼠心肌收缩力的影响。方法采用 Langendorff 逆行主动脉灌流法对大鼠离体心脏进行灌流，利用压力感受器插管法测定左心室相关心功能参数，记录低、中和高3个浓度Dio对左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末期压(LVEDP)、左心室内压最大上升/下降速率(±dp/dtmax)的影响。利用激光共聚焦显微镜观察Dio对H9c2细胞内Ca2+浓度的影响，并利用多功能酶标仪观察药物对细胞线粒体膜电位的影响。结果0.1、1 μmol·L-1Dio可明显增加LVSP，由(11.55±0.52)、(10.53±0.28) kPa分别增加至(13.08±0.72)、(12.53±0.64) kPa(P<0.01)；增加+dp/dtmax由(0.38±0.10)、(0.40±0.07) kPa·ms-1分别增加至(0.42±0.11)、(0.43±0.02) kPa·ms-1(P<0.05)。10 μmol·L-1Dio则使LVSP由(12.13±0.33) kPa减至(9.46±0.77) kPa(P<0.01)，使+dp/dtmax由(0.42±0.04) kPa·ms-1降为(0.24±0.04) kPa·ms-1(P<0.01)。0.1、1、10 μmol·L-1的Dio可使H9c2细胞中Ca2+相对荧光强度由(16.62±0.89)分别增加至(21.48±0.80)、(25.68±0.69)和(19.84±0.66)(P<0.01)。0.1、1 μmol·L-1Dio对H9c2细胞线粒体膜电位无明显影响，而10 μmol·L-1Dio会使JC-1单体与聚合物的比值由(1.14±0.03)增加为(1.35±0.06)(P<0.01)，即引起线粒体膜电位下降。结论低、中浓度Dio可增加LVSP和+dp/dtmax，表现正性肌力作用，机制为增加细胞内Ca2+浓度。并且，其在增加细胞内Ca2+浓度的同时并不会引起钙超载，仅高浓度出现。

关键词：薯蓣皂苷；Ca2+浓度；正性肌力作用；离子通道；钠钙交换体；左心室收缩压

心力衰竭在临床上可分为急性心力衰竭和慢性心力衰竭[1]，严重时可导致意识模糊甚至昏迷，并最终产生心源性休克。同时，心衰所致的电生理重构往往造成心肌动作电位时程延长[2-4]，继而延长QT间期，这又会增加恶性心律失常发生的风险而诱发猝死等。故随着人们对其危害性的普遍认知，心衰的防治策略越来越受瞩目。目前，临床上心衰的治疗主要是应用地高辛、洋地黄毒苷等具有正性肌力作用的强心苷类药物[5]，但是其在增加心肌收缩力的同时易引起室早、室速等心律失常，且增加心脏的负担，而未能改善心衰患者的预后并降低其死亡率[6]。因此，探索更加安全有效的抗心衰药物仍是今后研究的难点与热点。

我们发现不少研究[7-10]证实，天然甾体皂苷薯蓣皂苷(dioscin，Dio)具有抗炎、抗肿瘤和抗骨质疏松等多种药理作用。本室前期实验研究亦发现Dio对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤具有保护效应[11]，而且其在细胞水平可通过调节心肌钠、钙等离子通道而发挥抗缺氧/复氧诱导的心律失常作用。更为重要的是，我们前期研究还发现其具备一定的强心作用，且尚未见文献报道。因此，我们设想与强心苷类同属于甾体苷类的Dio产生的正性肌力作用是否与其相同？是否比其更低毒更安全？本实验将进行初步探索，以期揭示Dio作用特点和机制。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验对象健康、成年Wistar 大鼠，♂，体质量250~300 g，合格证号SCXK(京)2012-0004，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供；大鼠心肌细胞 H9c2 细胞株，购自中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心。

1.1.2药品与试剂Dio购自国家天然药物研究中心；JC-1和Fluo3-AM 钙离子荧光探针购自碧云天生物技术研究所。

1.1.3仪器GL-2 Langendorff 灌流装置、BL420-F生物机能实验系统，成都泰盟软件有限公司，中国；PHS-3C酸度计，上海精密科学仪器有限公司，中国；Millipore纯水系统，美国；OLYMPUS全电动倒置荧光显微镜，日本；Gemini XPS荧光读板机，美国。

1.1.4液体的配制K-H灌流液(mmol·L-1)：NaCl 118.06、KCl 4.69、MgSO41.18、CaCl22.5、NaHCO325、KH2PO41.18、Glucose 11.11,预充混合氧(95% O2+5% CO2)后调节pH至7.4。

1.2方法

1.2.1离体心脏Langendorff灌流法用25%乌拉坦麻醉大鼠，仰位固定于鼠台上，迅速剪开胸腔，暴露心脏，从主动脉根部离断取心脏，放入4℃生理盐水中去除脂肪及结缔组织。将主动脉逆行插管，以恒温(37℃)、充氧(95% O2+5% CO2)的K-H液8 mL·min-1灌流，灌注压为8~9 kPa左右。待心脏逐渐恢复跳动且残血排尽后，剪掉左心耳，将球囊压力感受器探头经左心房插入左心室。压力感受器经压力换能器与 BL420生物机能实验系统相连以记录左心室收缩曲线，采样频率为800点·s-1。心脏灌流稳定30 min，给药前5 min作为空白对照，然后给予药物干预。给药后20 min观察记录左心室各项心功能指标。

1.2.2细胞内钙离子浓度的测定以8×107·L-1的密度将细胞接种于共聚焦培养皿中，于孵箱中培养24 h后，与药液共孵育20 min。后加入Fluo3-AM工作液负载30 min，后用台氏液洗涤细胞3遍，向各组加入1 mL台氏液，避光孵育20~30 min。共聚焦显微镜下记录荧光信号，利用Image J软件计算胞内平均荧光强度。

1.2.3线粒体膜电位的测定以 4~5×107·L-1的密度将细胞接种于24孔板，接种48 h后用PBS冲洗2遍,给予相应含药培养基孵育20 min。后用PBS冲洗1遍，换上终浓度1.5 mg·L-1JC-1孵育20 min；孵育完成后，用PBS冲洗2遍，加入DMEM，放入酶标仪检测荧光值。

1.2.4实验分组① 正常对照组；② 低浓度0.1 μmol·L-1Dio组；③ 中浓度1 μmol·L-1Dio组；④ 高浓度10 μmol·L-1Dio组。

2结果

2.1Dio对大鼠离体心脏左心室各心功能指标的影响以给药前5 min作为正常对照，采用配对t检验比较各组给药前后各心功能指标差异。由BL-420系统记录到的左心室压力图像(Fig 1)。0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1Dio使LVSP明显增加近13%和18%(P<0.01)；+dp/dtmax增加约11%和9%(P<0.05)，同时HR减慢；10 μmol·L-1Dio则使LVEDP 明显增加(P<0.01)，而LVSP等其他指标均明显降低(P<0.01)，且实验过程中偶见心律失常。各浓度Dio下参数具体变化见Fig 2中给药后各参数与正常对照的比值。

2.2Dio对大鼠心肌细胞内钙离子浓度的影响Dio作用后Ca2+荧光强度变化如Fig 3和Fig 4所示。与正常对照组相比，0.1、1和10 μmol·L-1Dio均能使荧光强度增强(P<0.01)，其中1 μmol·L-1Dio效应最明显，使荧光强度增加约56.25%。

2.3Dio对大鼠心肌细胞线粒体膜电位的影响Dio作用后荧光比值变化如Fig 5所示。与正常对照组相比，0.1、1μmo1·Ｌ－１Dio孵育均未引起荧光比值明显变化（p＞ 0.05）。但10μｍｏ1·Ｌ－１Dio使该比值增加约18.42%（p＜0.01），显示该组线粒体膜电位降低。

Fig 1　Effects of dioscin on LVSP in isolated Langendorff-perfused rat heart(1 mmHg=0.133 kPa)

Fig 2　Effects of dioscin on cardiac functions in isolated

**P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Fig 3　Effects of dioscin on fluorescence intensity of

A:Control； B:0.1 μmol·L-1Dio；C:1 μmol·L-1Dio；D:10 μmol·L-1Dio

Fig 4　Effects of dioscin on fluorescence intensity of

***P<0.01vscontrol group

Fig 5　Effects of dioscin on mitochondrial membrane

***P<0.01vscontrol group

3讨论

本实验分别探索了Dio对心肌收缩力和细胞内Ca2+浓度的作用，低、中浓度Dio可使LVSP和+dp/dtmax明显增加，体现正性肌力作用。研究证实，舒张性心力衰竭患者，左室射血分数正常而-dp/dtmax明显降低。Dio可增加-dp/dtmax，在一定程度上改善左心室舒张功能，相较于传统的正性肌力药更有优势。

然而，高浓度Dio对心肌收缩力的作用却与低、中浓度相反，使LVSP和±dp/dtmax均减小，仅增加LVEDP。在实验过程中，在刚刚给予高浓度Dio时(5 min内)，可观察到LVSP有所增加，但随着灌流时间的延长，LVSP开始降低，甚至出现心律失常，这可能与高浓度Dio过分增加LVEDP，使得容量负荷过度有关。

心肌收缩功能与细胞内Ca2+水平密切相关[12-13]。我们由当前研究发现Dio的急性作用可使Ca2+荧光强度增强，这表明Dio与洋地黄强心苷类药物作用方式相似，即通过增加心肌细胞内Ca2+浓度而发挥正性肌力作用。这引发了我们对于Dio在提升细胞内Ca2+水平的同时是否会导致钙超载，以及其诱导Ca2+浓度增加的机制产生了思考。

首先，线粒体膜电位的测定结果显示，低、中浓度Dio对荧光比值无明显改变，即不由此引发细胞损伤。同时，其仅在10倍于中浓度的高浓度下才使该比值有一定升高，这与离体水平上高浓度的不良效果较为一致。但是与洋地黄毒苷类强心药易引发心律失常，增加心脏负荷相比，Dio似乎仍显示出更优的安全性，因为在1 μmol·L-1浓度时，Dio增加细胞内Ca2+浓度和心肌收缩力在本实验中最明显，而此时并未见心律失常以及钙超载所致的线粒体膜电位下降，显示出Dio在发挥正性肌力作用上可能具备一定优势。

其次，细胞内Ca2+浓度的增加表明Dio并非如左西孟坦等钙增敏剂，通过增加心肌收缩蛋白对Ca2+的敏感性来发挥强心作用[14]。另外，我们前期实验又证实Dio可减少L-型Ca2+通道介导的内向钙电流[15]，这表明L-型Ca2+通道不是Dio增加Ca2+浓度的途径。因此，其机制有待于进一步研究。再有，我们前期结果还显示Dio能够增加内向钠电流[16]。联想到临床上使用的洋地黄类药物通过抑制心肌Na+-K+-ATP酶活性，使细胞内Na+增多，从而通过钠钙交换体(sodium-calcium exchanger，NCX)使细胞Ca2+内流增加，产生正性肌力作用[17]。Flesch等[18]也认为，钠通道激活剂产生正性肌力作用的机制与钠钙交换活动增强有关。另外，进入细胞的Ca2+也可触发肌浆网释放Ca2+[19]。我们据此推测，Dio增强心肌收缩力的作用可能与影响钠钙交换体相关。因此，下一步我们将观察Dio是否通过上述机制增加胞内Ca2+浓度以证明我们的设想。

总之，我们证实Dio通过增加胞内Ca2+浓度产生正性肌力作用，还能改善舒张功能，仅高浓度时才产生一定的钙超载，基本符合理想正性肌力药的要求[20]。当然，本实验目前仅初步发现Dio的正性肌力作用，还尚未对其作用原理进行深入探究，故今后我们将从多途径，如NCX电流以及进出肌浆网的Ca2+浓度变化等进行观察以阐明其机制。同时，Dio对病理情况下心肌收缩力的作用也亟待探索。

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Effects of dioscin on rat myocardial contractility

HAN Yu, YANG Fan, CONG Tian-shen, SUN Kai, LI Yan, KANG Yi, YIN Yong-qiang, LOU Jian-shi

(DeptofPharmacology,BasicMedicalCollege,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:AimTo investigate the effects of dioscin (Dio) on rat myocardial contractility. MethodsLeft ventricular contractile function was measured using the Langendorff non-recirculating mode of isolated rat heart perfusion. Effects of low, middle and high concentration of Dio were investigated by measuring left ventricular systolic pressure (LVSP) and left ventricular end diastolic pressure (LVEDP). Also, peak rates of rise/fall of left ventricular pressure (±dp/dtmax) of isolated rat heart were calculated. Effects of Dio on intracellular free calcium concentration in rat H9c2 cells were measured by using the confocal microscopy. Mitochondrial membrane potential was detected with multifunctional microplate reader. ResultsWith 0.1, 1 μmol·L-1Dio, LVSP were significantly enhanced from (11.55±0.52), (10.53±0.28) kPa to (13.08±0.72), (12.53±0.64) kPa(P<0.01); +dp/dtmaxwere dramatically increased from (0.38±0.10), (0.40±0.07) kPa·ms-1to (0.42±0.11), (0.43±0.02) kPa·ms-1(P<0.05). With the 10 μmol·L-1Dio, LVSP and +dp/dtmaxwere both decreased from (12.13±0.33) kPa and (0.42±0.04) kPa·ms-1to (9.46±0.77) kPa and (0.24±0.04) kPa·ms-1(P<0.01). With 0.1, 1, 10 μmol·L-1Dio, the relative fluorescence intensity of intracellular free calcium concentrations was increased significantly from (16.62±0.89) to (21.48±0.80), (25.68±0.69) and (19.84±0.66)(P<0.01)respectively. 0.1, 1 μmol·L-1Dio showed no significant effects on the mitochondrial membrane potential of rat H9c2 cells, while with effects of 10 μmol·L-1Dio, the ratio of JC-1 monomer and J-aggregates was changed from (1.14±0.03) to (1.35±0.06)(P<0.01), indicating a decrease in the mitochondrial membrane potential. ConclusionLow and middle concentrations of Dio show a positive inotropic effect on isolated rat heart, as the LVSP and +dp/dtmaxare enhanced, which may concern with the increase of the intracellular concentration of Ca2+. It will not cause the calcium overload while the intracellular concentration of Ca2+is increased by low and middle concentration of Dio in the myocytes except high concentration of Dio.

Key words:dioscin; concentration of Ca2+; positive inotropic effect; ion channel; sodium-calcium exchanger; left ventricular systolic pressure

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)02-0258-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.021

作者简介：韩钰(1990-)，男，硕士生，研究方向：心血管药理学，E-mail:18622272148@163.com;尹永强(1980-)，男，博士，讲师，研究方向：心肌细胞离子通道，通讯作者，Tel:022-83336835，E-mail:13820043633@126.com；娄建石(1954-)，男，硕士，教授，博士生导师，研究方向：心血管药理学，通讯作者，Tel: 022-83336860，E-mail:jianshilou@163.com

基金项目：天津应用基础及前沿技术研究计划青年项目(No 14JCQNJC13700)

收稿日期：2015-10-26，修回日期：2015-12-02

网络出版时间：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.042.html网络出版地址：2016-1-25 15:57