胰岛素抵抗肝癌细胞IGF-1R/NF-κB表达及多药耐药机制研究*

王以浪，印滇，杨莉，张亮，姚登福

·原发性肝癌·

胰岛素抵抗肝癌细胞IGF-1R/NF-κB表达及多药耐药机制研究*

王以浪，印滇，杨莉，张亮，姚登福

目的探讨胰岛素抵抗（IR）肝癌细胞胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）和核因子-κB（NF-κB）表达变化及多药耐药（MDR）发生机制。方法采用高浓度胰岛素诱导人肝癌细胞（HepG2和HepG2.2.15）建立胰岛素抵抗（IR）细胞模型。采用Western blot法检测胰岛素受体（InsR）、IGF-1R、NF-κB和P-糖蛋白（P-gp）表达变化。使用流式细胞仪（Annexin V-FITC法）检测阿霉素对细胞凋亡的影响。结果分别用100 nmol/L和1 000 nmol/L胰岛素培养HepG2和HepG2.2.15细胞48 h，成功建立IR肝癌细胞模型；IR肝癌细胞IGF-1R、NF-κB、P-gp表达上调，而InsR表达下调；应用25μg/mL阿霉素作用细胞24 h后，IR-HepG2细胞组凋亡率（31.1%±1.9%）显著低于HepG2细胞组【（49.7%±2.2%），P＜0.01】，IR-HepG2.2.15细胞凋亡率【（20.1±1.7）%】显著低于HepG2.2.15细胞【（33.8±1.8）%，P＜0.01】；HepG2.2.15和IR-HepG2.2.15细胞凋亡率分别较HepG2和IR-HepG2细胞显著降低（P＜0.01）。结论IGF-1R/NF-κB/P-gp过表达可能介导IR肝癌细胞对阿霉素的多药耐药。

HepG2细胞；胰岛素抵抗；胰岛素样生长因子1受体；核因子-κB；P糖蛋白；多药耐药

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一。我国HBV相关性HCC约占80%，而代谢异常也是重要的致病因素[1-2]。近来研究显示，2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者HCC发病率明显增高[3-4]。胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是指各种原因使胰岛素靶器官（肝、脂肪、骨骼肌等）对胰岛素的敏感性降低，导致β细胞代偿性分泌过多胰岛素，出现高胰岛素血症。IR是T2DM发病的核心环节[5]。胰岛素与胰岛素受体（insulin receptor，Ins R）和胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）结合，介导下游信号通路传递，并与HCC发生关系密切[6]。P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）表达上调与肿瘤多药耐药（multi-drug resistance，MDR）表型形成密切相关[7]。我们前期研究提示核因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）可诱导肝癌细胞P-gp过表达及MDR形成,而抑制NF-κB表达可以逆转MDR[8-10]。有研究显示，胰岛素可诱导多种细胞P-gp表达上调，介导MDR[11-12]，但胰岛素能否诱导人肝癌细胞多药耐药以及其作用机制尚不清楚。本研究采用高浓度胰岛素加入细胞培养液，诱导人肝癌细胞（HepG2和HepG2.2.15）培养，建立肝癌细胞IR模型，观察了细胞Ins R、IGF-1R、NF-κB和P-gp等表达的变化，以探讨IR肝癌细胞对阿霉素多药耐药的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂人肝癌细胞HepG2和整合HBV DNA的HepG2.2.15细胞株购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。胰岛素、琼脂糖、溴化乙锭、二乙基焦炭酸、无酚红RPMI 1640培养基（Sigma公司）；新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；鼠抗人InsR-β抗体（ab983）、兔抗人InsR-β磷酸化（Y1361）抗体（ab60946）、兔抗人IGF-1R抗体（ab39675）、抗IGF-1R磷酸化（Y1161）抗体（ab39398）、兔抗人p65磷酸化（S536）抗体（ab86299）、兔抗人P-gp抗体（ab10347，美国Abcam公司）；兔抗人核因子-κB抑制蛋白α（IκBα）抗体（SAB4501995，Sigma公司），羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG（美国Jackson公司）。

1.2 IR肝癌细胞模型建立取HepG2和HepG2. 2.15细胞，复苏后用含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养液在37℃、5%CO2条件下培养。当细胞贴壁长满后，倾去培养基,用0.25%胰蛋白酶消化。根据细胞生长情况传代。取对数生长期细胞接种于无血清的RPMI 1640培养液中，待细胞完全贴壁，分别加入1、10、100、1 000和10 000 nmol/L的胰岛素，孵育24 h、48 h和60 h，用葡萄糖氧化酶法测定培养上清液葡萄糖含量。计算空白组与不同胰岛素浓度组细胞葡萄糖消耗量差值，选择葡萄糖消耗量差值最小，即达到胰岛素抵抗最高状态的胰岛素作用浓度为胰岛素最佳浓度。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定各组细胞活性。

1.3 细胞蛋白表达检测分别将各组细胞接种于6孔板中，培养48 h后，弃培养液，经PBS洗涤，胰酶消化，1000 r/m离心5 min，收集细胞，弃上清液，冰上操作:按照1×106个细胞加细胞裂解液100 μl和PMSF 1μl裂解细胞，冰上静置10 min，4℃，12000 r/m离心15 min，收集上清液，以BCA法测定蛋白浓度。采用Western blot法检测蛋白表达，取蛋白样品20μg，加至0.5 mL EP管内，加上样缓冲液按比例稀释蛋白，混匀后于沸水中煮5 min，使蛋白变性。制作10%分离胶和4%浓缩胶。向电泳槽内加入电泳缓冲液，每道上样蛋白样品20μg，先80 V×35 min，然后改为100 V×60 min。在电泳结束后，以恒流300 mA×110 min转膜。转膜结束后，以TBS-T洗涤缓冲液脱色摇床上漂洗5 min，2次，TBS洗5 min。将膜转移至封闭液，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h。取出膜，用TBS-T漂洗10 min，2次，TBS洗涤10 min。然后，加入一抗，4℃过夜，TBS-T漂洗5 min，2次，TBS洗5 min，加入二抗，室温孵育2 h，漂洗、DAB显色并摄像。

1.4 细胞凋亡检测采用Annexin V-FITC法，取25μg/mL阿霉素加入各组肝癌细胞培养液中，共培养24 h。分别收集各组细胞，离心，吸净上清，PBS洗涤细胞2次。加入Annexin V-FITC结合液195μl，轻轻重悬细胞，再加入Annexin V-FITC 5 μl，轻轻混匀，室温避光孵育10 min。离心，弃上清，加入Annexin V-FITC结合液190μl，轻轻重悬细胞。加入PI染色液10μl，轻轻混匀，冰浴、避光放置。使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，每组检测3次，取平均值。

2 结果

2.1 胰岛素对肝癌细胞存活率的影响应用不同浓度的胰岛素作用HepG2和HepG2.2.15细胞不同时间后，各浓度组胰岛素均有抑制肝癌细胞增殖的作用。与1 000 nmol/L胰岛素组比，10 000 nmol/L胰岛素作用HepG2（t=5.57，P＜0.01）和HepG2.2.15细胞（t=7.25，P＜0.01）24 h，对细胞活性抑制明显增强，差别有统计学意义（图1）。

图1 胰岛素对肝癌细胞存活率的影响A：与1 000nmol/L胰岛素作用HepG2细胞24 h组比，#P＝0.02；B：与1 000nmol/L胰岛素作用HepG2.2.15细胞24 h组比，#P＝0.01

2.2 IR肝癌细胞模型建立成功100 nmol/L胰岛素作用HepG2细胞24 h、48 h和72 h，培养上清液葡萄糖浓度分别为（9.8±0.12）mmol/L、（9.5± 0.25）mmol/L和（8.9±0.21）mmol/L，作用48 h细胞培养上清液葡萄糖浓度与作用24 h比无显著性差异（t=1.87，P＝0.13），作用72 h培养上清液葡萄糖浓度较作用48 h无明显下降（t=3.18，P＝0.03，图2A）；1 000 nmol/L浓度胰岛素作用HepG2.2.15细胞24 h、48 h和72 h，培养上清液葡萄糖浓度分别为（9.6±0.17）mmol/L、（9.2±0.20）mmol/L和（8.8± 0.18）mmol/L，作用48 h细胞培养上清液葡萄糖浓度与作用24 h比无显著性差异（t=2.64，P＝0.06），作用72 h培养上清液葡萄糖浓度较作用48 h无明显下降（t=2.57，P＝0.06，图2B）；100 nmol/L和1 000nmol/L胰岛素分别作用HepG2细胞和HepG2.2.15细胞48 h，细胞培养上清液葡萄糖消耗量较作用24 h无显著降低，形成胰岛素抵抗，并能维持72 h。

图2 不同浓度胰岛素诱导肝癌细胞葡萄糖消耗变化（A、B）与0 h组比，#P＞0.05；与24 h组比，△P＜0.05；与48 h组比，*P＜0.05

2.3 IR肝癌细胞IsnR-β和IGF-1R表达变化与HepG2细胞和HepG2.2.15细胞比，胰岛素诱导后形成的IR-HepG2细胞和IR-HepG2.2.15细胞IsnR-β和P-IsnR-β表达下调，而IGF-1R和P-IGF-1R表达上调（图3）。

图3 IR肝癌细胞蛋白表达变化IR肝癌细胞IsnR-β蛋白表达对照组肝癌细胞下调，而IGF-1R表达上调

2.4 IR肝癌细胞P-p65、IκBα和P-gp表达变化与HepG2细胞和HepG2.2.15细胞比，IR-HepG2细胞和IR-HepG2.2.15细胞P-p65和P-gp表达上调，而IκBα表达下调；整合HBV DNA的HepG2.

2.15 和IR-HepG2.2.15细胞P-gp表达较HepG2和IR-HepG2增强（图4）。

图4 IR肝癌细胞P-p65和P-gp表达的变化IR肝癌细胞P-p65和P-gp表达较对照组肝癌细胞上调，而IκBα表达下调

2.5 IR肝癌细胞耐受阿霉素诱导凋亡在25μg/ mL阿霉素作用细胞24 h后，IR-HepG2细胞凋亡率为（31.1±1.9）%，显著低于HepG2细胞的【（49.7± 2.2）%，P＜0.01】；IR-HepG2.2.15细胞凋亡率为（20.1± 1.7）%，显著低于HepG2.2.15细胞组的【（33.8± 1.8）%，P＜0.01】；HepG2.2.15和IR-HepG2.2.15细胞凋亡率分别较HepG2和IR-HepG2细胞显著降低（P＜0.01，图5）。

图5 肝癌细胞凋亡率的变化（A、B）经阿霉素诱导后，IR肝癌细胞凋亡率显著低于对照组肝癌细胞

3 讨论

IR是T2DM发病的主要始动因素，也是代谢综合征的中心环节和基本致病基础。T2DM与HCC发生、发展、治疗和预后密切相关[13]。IR和高胰岛素血症介导了T2DM和代谢综合征与恶性肿瘤发病之间的桥梁关系。有研究表明T2DM与许多实体恶性肿瘤密切相关，尤其是HCC[14，15]。意大利学者的一项研究表明有31.2%HCC患者患有T2DM，而正常人群T2DM患病率仅为12.7%。一项荟萃分析显示患有T2DM患者患HCC的风险是正常人的2.31倍，其中使用外源性胰岛素治疗的糖尿病患者患HCC风险是不使用胰岛素患者的4倍，而死亡风险增加1.43倍，提示胰岛素不仅参与HCC的形成，而且通过增加化疗药物的多药耐药而影响HCC患者的治疗效果。由此可见，T2DM是HCC的独立危险因素，其中高胰岛素血症可能起了重要作用[16，17]。

胰岛素、IsnR、IGF-1R和下游靶基因构成胰岛素信号轴，介导机体病理生理过程[18]。其中IGF-1R与恶性肿瘤密切相关，其在HCC表达上调，阻断IGF-1R使肝癌细胞生长受抑、诱导细胞凋亡，增加放、化疗敏感性[19，20]。本研究用高浓度胰岛素诱导肝癌细胞，在胰岛素作用肝癌细胞后24 h即能诱导肝癌细胞形成IR，并能维持72 h。经Western blot检测显示IsnR和磷酸化IsnR表达下调，抑制细胞对葡萄糖消耗，符合胰岛素抵抗特征。但作为胰岛素的另一受体IGF-1R和磷酸化IGF-1R表达却明显上调，推测其可能介导了胰岛素诱导的细胞分裂、增殖和凋亡抑制等。

MDR基因编码的细胞膜P-gp是一种ATP依赖的流出泵，一旦与抗肿瘤药物结合，通过ATP提供能量就可将药物从细胞内泵出细胞外，出现耐药现象。恶性肿瘤细胞往往高表达P-gp[21]。有研究显示胰岛素可诱导P-gp表达，其具体机制尚不明确[22，23]。NF-κB是首先在B细胞中发现的一种结合于免疫球蛋白κ轻链增强子上的核蛋白，有RelA（p65）、RelB、C-Rel、NF-κB1（p50）和NF-κB2（p52）五个亚基，亚基间可形成同源或异源二聚体，其中p50/p65二聚体最常见。NF-κB是胰岛素信号通路下游重要靶点，我们前期研究显示抑制NF-κB后HepG2细胞P-gp表达显著下调。本研究发现IR肝癌细胞NF-κB亚单位磷酸化的p-65（P-p65）和多P-gp表达较肝癌细胞显著增强；采用流式细胞仪检测经阿霉素诱导的细胞凋亡显示阿霉素诱导的IR肝癌细胞凋亡率较肝癌细胞明显减低。上述结果提示NF-κB可能介导了胰岛素诱导的肝癌细胞P-gp表达及对阿霉素的多药耐药。

HBV相关性肝癌高耐药性是HCC化疗不敏感的主要原因。本研究提示整合HBV DNA的HepG2.2.15细胞P-gp蛋白表达较HepG2细胞增高，对阿霉素有更高的耐药性，但其具体机制尚不清楚。

本研究以高浓度胰岛素诱导肝癌细胞形成IR肝癌细胞模型，研究提示NF-κB介导了胰岛素/IGF-1R诱导肝癌细胞P-gp表达及对阿霉素的多药耐药，推测HBV可能与肝癌细胞多药耐药相关，这些结果可能为肝癌的耐药逆转提供了潜在的靶点。

[1]Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics. 2012.CA Cancer J Clin，2015，65（2）:87-108.

[2]Yang JD，Roberts LR.Hepatocellular carcinoma:A global view. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2010，7（8）:448-458.

[3]Shikata K，Ninomiya T，Kiyohara Y.Diabetes mellitus and cancer risk:review of the epidemiological evidence.Cancer Sci，2013，104（1）:9-14.

[4]Chettouh H，Lequoy M，Fartoux L，et al.Hyperinsulinaemia and insulin signalling in the pathogenesis and the clinical course of hepatocellular carcinoma.Liver Int，2015，35（10）: 2203-2217.

[5]Ohta Y，Tanizawa Y.Insulin secretion and insulin resistance. Nihon Rinsho，2013，71（11）:1936-1940.

[6]De Minicis S，Agostinelli L，Rychlicki C，et al.HCC development is associated to peripheral insulin resistance in a mouse model of NASH.PLoSOne，2014，9（5）:e97136.

[7]Lopes-Rodrigues V，Seca H，Sousa D，et al.The network of P-glycoprotein and microRNAs interactions.Int J Cancer，2014，135（2）:253-263.

[8]Shi Y，Wang SY，Yao M，et al.Chemosensitization of HepG2 cells by suppression of NF-κB/p65 gene transcription with specific-siRNA.World JGastroenterol，2015，21（45）:12814-12821.

[9]姚敏，顾星，姚登福，等.肝癌患者核因子-κB异常表达及转录干预对多药耐药的逆转效果.中华医学杂志，2016，96（10）: 761-766.

[10]吴玮，姚敏，王以浪，等.TNF-α/NF-κB通路干预对肝癌多药耐药相关P-gp表达的影响.南通大学学报（医学版），2013，33（1）:13-17.

[11]Nawa A，Fujita-Hamabe W，Tokuyama S.Altered intestinal P-glycoprotein expression levels in a monosodium glutamate-induced obesemouse model.Life Sci，2011，89（23-24）:834-838.

[12]Kobori T，Harada S，Nakamoto K，et al.Functional alterations of intestinal P-glycoprotein under diabetic conditions.Biol Pharm Bull，2013，36（9）:1381-1390.

[13]Siddique A，Kowdley KV.Insulin resistance and other metabolic risk factors in the pathogenesis of hepatocellular carcinoma. Clin Liver Dis，2011，15（2）:281-296.

[14]Sugimoto K，Takei Y.Clinicopathological features of non-alcoholic fatty liver disease.Hepatol Res.2011，41（10）:911-920.

[15]Starley BQ，Calcagno CJ，Harrison SA.Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma:a weighty connection. Hepatology，2010，51（5）:1820-1832.

[16]Wang P，Kang D，Cao W，et al.Diabetes mellitus and risk of hepatocellular carcinoma:a systematic review and meta-analysis. Diabetes Metab Res Rev，2012，28（2）:109-122.

[17]Chao LT，Wu CF，Sung FY，et al.Insulin，glucose and hepatocellular carcinoma risk in male hepatitis B carriers:results from 17-year follow-up of a population-based coho rt. Carcinogenesis，2011，32（6）:876-881.

[18]Burnol AF，Morzyglod L，Popineau L.Cross-talk between insulin signaling and cell proliferation pathways.Ann Endocrinol（Paris），2013，74（2）:74-78.

[19]姚宁华，姚登福，董志珍，等.足叶苦素抑制胰岛素样生长因子I受体表达对肝癌细胞增殖与运动的影响.中华肝脏病杂志，2013，21（5）:376-380.

[20]Yan XD，Yao M，Wang L，et al.Overexpression of insulin-like growth factor-Ireceptor as a pertinent biomarker for hepatocytes malignant transformation.World J Gastroenterol，2013，19（36）: 6084-6092.

[21]Hu Y，Li C，Li H，et al.Resveratrol-mediated reversal of tumor multi-drug resistance.Curr Drug Metab，2014，15（7）:703-710.

[22]Nawa A，Fujita Hamabe W，Tokuyama S.Altered intestinal P-glycoprotein expression levels in a monosodium glutamate-induced obesemousemodel.Life Sci，2011，89（23-24）:834-838.

[23]Nawa A，Fujita Hamabe W，Tokuyama S.Inducible nitric oxide synthase-mediated decrease of intestinal P-glycoprotein expression under streptozotocin-induced diabetic conditions.Life Sci，2010，86（11-12）:402-409.

（收稿：2016-06-20）

（本文编辑:陈从新）

Exp ression of IGF-1R/NF-kappa B and multi-d rug resistance in insulin resistance-HepG2 and HepG2. 2.15 cells in vitro

Wang Yilang，Yin Dian，Yang Li，et al.
Department of Oncology，Research Center of Clinical Medicine，First People's Hospital A ffiliated to Nantong University，Nantong，226001，Jiangsu Province，China Corresponding author:Yao Dengfu，E-mail:yaodf@ahnmc.com

Ob jective To investigate the expression of insulin-like growth factor 1 receptor（IGF-1R），nuclear factor-κB（NF-κB）and the mechanism of multi-drug resistance（MDR）in insulin resistance（IR）-hepatoma cells in vitro.Methods The human hepatoma cells（HepG2 and HepG2.2.15）were induced by high concentration of insulin to establish a insulin resistance model.The expression of insulin receptor（InsR），IGF-1R，NF kappa B，P glycoprotein（P-gp）were detected by Western bloting and the effect of adriamycin on cell apoptosis were detected by flow cytometry（annexin V-FITC）.Resu lts IR model of hepatoma cells were established successfully by subjecting the HepG2 and HepG2.2.15 cells to 100 nmol/L and 1 000 n mol/L insulin respectively for 48 hours.The expression of IGF-1R，NF-kappa B and P-gp were up-regulated in IR hepatoma cells，while the InsR expression was down-regulated；After treatment of the two cells with 25μg/m l doxorubicin for 24 hours，the apoptosis rate of IR-HpeG 2 cells（31.1%±1.9%）was significantly lower than HepG2 cells[（49.7± 2.2）%，P＜0.01]，and the apoptosis rate of IR-HepG2.2.15 cells（20.1±1.7）%was significantly lower than HepG2.2.15 cells[（33.8±1.8）%，P＜0.01]；The apoptotic rates of HepG2.2.15 or IR-HepG2.2.15 cells were significantly lower than HepG2 or IR-HepG2 cells（P＜0.01），respectively.Conclusion The expression of IGF-1R，NF-kappa B and P-gp are up-regulated in IR-hepatoma cells，which might induce the MDR to adriamycin.

HepG2 cells；Insulin resistance；Insulin-like growth factor I receptor；NF-kappa B；P-glycoprotein；Multi-drug resistance

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.06.016

南通市卫生局青年医学人才科研基金项目（编号：WQ2014005）

226001江苏省南通市第一人民医院肿瘤科（王以浪，印滇，杨莉，张亮）；南通大学附属医院临床研究中心（姚登福）

王以浪，男，34岁，医学硕士，主治医师。从事肿瘤学基础及临床研究。E-mail：oncowang@163.com

姚登福，E-mail：yaodf@ahnmc.com