应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱联合磁珠技术寻找肺癌血清蛋白标志物

谢静，朱乾坤，朱莉思，肖刻，朱威，诸葛斯亮，朱朝晖，吴志宏

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院1中心实验室2骨科3核医学科，北京100730

应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱联合磁珠技术寻找肺癌血清蛋白标志物

谢静1，朱乾坤2，朱莉思1，肖刻2，朱威2，诸葛斯亮2，朱朝晖3，吴志宏1

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院1中心实验室2骨科3核医学科，北京100730

目的建立肺癌蛋白质指纹图谱诊断模型，探讨用于肺癌早期诊断及手术疗效评估的血清蛋白标志物。方法收集38例肺癌患者、12例肺部良性肿瘤患者及32名正常对照者的血清标本，应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)联合磁珠技术，获得蛋白质指纹图谱，采用BPS分析软件对数据分组及相关性进行分析，初步建立肺癌的血清蛋白质指纹图谱诊断模型，并验证其诊断效率;同时对比肺癌患者手术前后的差异蛋白质谱，结合肺癌的诊断模型，选取合适的蛋白作为肺癌手术疗效的观察指标。结果在质荷比为1000～50 000范围内，肺癌患者、肺部良性肿瘤患者和正常对照者之间共检测到215个蛋白质峰。其中，质荷比为1115.37、1929.70、3217.57、3246.34、3318.57、11 508.90的6个蛋白质峰表达差异具有统计学意义(P＜0.05)。决策树模型对肺癌的原始判别敏感性为92.11%(35/38)，特异性为90.91%(40/44);交叉验证敏感性为86.67%(13/15)，特异性为86.67%(13/15)。其中质荷比为1115.37、1929.70、3246.34和11 508.90的蛋白质峰在肺癌患者中明显升高(P＜0.05)，当肺癌患者手术治疗后表达量较术前明显降低(P＜0.01)，表明这4个蛋白质峰对肺癌的诊断及疗效判定具有潜在应用价值。结论应用SELDI-TOF-MS技术建立的肺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型具有较高的敏感性和特异性，为发现肺癌早期生物标志物并判断疗效奠定基础。

肺癌;肿瘤标志物;诊断;蛋白质组学;表面增强激光解吸电离飞行时间质谱

Med J PUMCH，2016，7(6):416－420

肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，全国第三次死因回顾调查报告显示，肺癌是我国居民第1位肿瘤死因。肺癌死亡率在近30年上升了464.84%，成为我国死亡率增长幅度最大、危害最为严重的恶性肿瘤［1］。目前，肺癌的筛查和早期诊断主要依靠胸部X线、低剂量CT、支气管镜、痰细胞学及肿瘤标志物检查，但这些方法的敏感性和特异性有限，难以进行早期诊断，贻误了肺癌的最佳诊疗时机［2］。迄今尚缺乏特异敏感的可用于肺癌临床诊断的分子标志物。

表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(surfaceenhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)技术是近年发展起来的蛋白质组学研究方法，利用激光脉冲将芯片上的分析物离子化，计算带有不同质荷比的离子在电场中的飞行时间，绘制成不同质谱，经计算机软件分析，显示出蛋白的各种信息。SELDI技术具有快速、简便、敏感、样品用量少等优点，是蛋白质组学研究中常见的实验技术。

本研究利用SELDI-TOF-MS技术检测肺癌患者、肺部良性肿瘤患者和正常对照者的血清蛋白质指纹图谱并进行分析，以建立肺癌的血清蛋白质指纹图谱诊断模型，同时结合肺癌的诊断模型对比肺癌患者手术前后的差异蛋白质谱，旨在为肺癌的早期诊断及疗效评估提供依据。

对象和方法

研究对象

肺癌及肺部良性肿瘤血清标本取自2006年8月至2008年9月在北京协和医院核医学科PET中心就诊的患者。其中肺癌患者共38例，男性29例，女性9例，年龄43～79岁，平均年龄62岁;所有患者均经病理诊断确诊。肺部良性肿瘤患者共12例，男性10例，女性2例，年龄28～76岁，平均年龄54岁。正常对照血清标本取自同期本院健康体检者，共32名，其中男性25名，女性7名，年龄41～73岁，平均年龄58岁;所有正常对照者均无其他相关疾病。受试者于清晨空腹抽取静脉血(其中肺癌患者手术前后分别取血)，4℃冰箱静置2 h，4000×g低温离心10 min后，分装血清(每管100 μl)，并置－80℃冰箱保存。所有参与本研究的受试者均签署知情同意书。

试剂和仪器

乙腈(HPLC级)、三氟乙酸、无水醋酸钠、3-［3-(胆酰胺丙基)二甲铵基］丙磺酸钠盐(CHAPS)、Tris碱、芥子酸、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)等购自美国Sigma公司。WCX2(弱阳离子交换纳米磁珠)购自长春博坤生物技术有限公司，PBSⅡC型号蛋白飞行质谱仪购自美国BIORAD公司。蛋白质指纹图谱分析软件Biomarker Wizard 3.1.0和Biomarker Patterns Software(BPS)5.01由美国BIORAD公司提供。

实验方法

样品准备:取冻存血清4℃融解后，1000×g离心10 min;向10 μl血清中加入20 μl U9缓冲液(含5 ml 9 mol/L尿素、2%CHAPS、50 mmol/L Tris-Hcl，pH 9.0)，充分混匀，室温下静置30 min;然后加入WCX2缓冲液370 μl，使血清浓度稀释40倍。磁珠与蛋白结合前需进行预处理，每个200 μl EP管中加入磁珠50 μl，放置磁力架上静置1 min，弃上清。管中加入WCX2缓冲液(无水醋酸钠，pH 4.0)100 μl，充分混匀，静置5 min，再次置于磁力架并弃去上清;重复上步操作。吸取100 μl WCX2缓冲液加入处理好的蛋白与磁珠充分混匀，室温静置30 min。弃去上清，并用WCX2缓冲液漂洗2次;加入10 μl 0.5%三氟乙酸，洗脱8 min;取5 μl上清液与等体积的WCX2缓冲液混匀，抽取2 μl混合液加样到钢芯片上，室温下风干。

数据收集:待芯片干燥后，放入PBSⅡC质谱仪进行数据收集。统一采用激光强度为195，灵敏度为8的模式，对芯片进行扫描，采集120次数据，取平均值。用Biomarker Wizard 3.1.0软件检测蛋白峰，设定首次信噪比为5，最小峰阈值10%;二次信噪比为3，以质荷比6634.0作为标准化值，设定质荷比范围为1000～50 000，根据数据情况，分别选取各组之间表达有差异的蛋白峰作为分析对象。

统计学处理

将所得数据导入BPS 5.01分析软件分析数据，建立树形结构模型图。用SPSS 13.0软件对BPS确立的各个节点进行分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

肺癌患者、肺部良性肿瘤患者和正常对照者血清蛋白质图谱比较

肺癌患者、肺部良性肿瘤患者和正常对照者之间共检测到215个质荷比在1000～50 000范围之间的蛋白质峰。为便于更好地进行统计学分析，检测结果在良性肿瘤组与正常对照组差异无统计学意义的基础上，将两组合并为一组分析。采用BPS分析软件对各组标记蛋白分析发现，有6个蛋白质峰的表达差异有统计学意义(独立样本t检验，P＜0.05)。肺癌组中质荷比为1115.37、1929.70、3246.34、11 508.90的蛋白质峰强度显著高于肺部良性肿瘤及正常对照组，而质荷比为3217.57和3318.57的蛋白质峰强度显著低于肺部良性肿瘤及正常对照组(P均＜0.05)(表1)。质荷比为11 508.90的蛋白质峰在肺癌组与正常对照组间的差异表达见图1。

表1 肺癌组与肺部良性肿瘤及正常对照组的蛋白质峰表达差异(±s)

表1 肺癌组与肺部良性肿瘤及正常对照组的蛋白质峰表达差异(±s)

质荷比肺癌组肺部良性肿瘤及正常对照组t值P值1115.370.36±0.510.07±0.632.2480.027 1929.700.63±1.580.02±1.742.4620.016 3217.571.46±1.722.81±2.28－2.8970.004 3246.341.79±1.930.97±1.742.0220.047 3318.576.90±5.449.78±5.47－2.3740.002 11 508.900.91±1.640.32±0.96－2.0320.045

图1 质荷比在10 000～12 000范围内WCX2磁珠捕获到的差异蛋白峰其中11 508.90蛋白质峰(箭头)强度在肺癌组与正常对照组间呈差异表达，肺癌组蛋白质峰强度显著高于正常对照组

肺癌患者、肺部良性肿瘤患者及正常对照者蛋白质谱差异表达模型的建立

以表达量具有显著差异的6个蛋白质峰为依据，组合构建分类决策树模型，分出4个终节点(图2)。决策树模型对肺癌的原始判别敏感性为92.11%(35/ 38)，特异性为90.91%(40/44);交叉验证敏感性为86.67%(13/15)，特异性为86.67%(13/15)(表2)。

表2 肺癌组和肺部良性肿瘤及正常对照组蛋白质谱差异模型敏感性及特异性［例(%)］

肺癌患者手术前后蛋白质谱差异表达

肺癌患者手术前后对比，肺癌的6个蛋白峰的表达差异均具有统计学意义(t检验，P＜0.01)(表3)。其中质荷比为1115.37、1929.70、3246.34、11 508.90的4个蛋白质峰手术后表达强度降低与其在正常对照者中较肺癌患者中降低的趋势相符。

表3 肺癌患者手术前后蛋白质谱表达的差异(n=38，±s)

表3 肺癌患者手术前后蛋白质谱表达的差异(n=38，±s)

质荷比治疗前治疗后t值P值1115.370.36±0.510.23±0.61－3.1950.003 1929.700.63±1.580.36±1.29－2.8610.006 3217.571.46±1.720.97±1.53－3.3960.001 3246.341.79±1.931.63±2.30－2.7770.008 3318.576.90±5.443.78±3.20－3.4660.001 11 508.900.91±1.640.74±1.74－4.1950.000

讨论

由于肺癌早期无明显临床症状，临床上仍缺乏敏感特异的肺癌诊断标志物和早期诊断方法。因此，绝大多数患者在确诊肺癌时已为中晚期，错过了手术治疗的最佳时期，只能进行放射治疗和化学治疗。目前临床上对肺癌的诊断主要依靠影像学表现，如胸部X线平片和低剂量多排螺旋CT可以提高肺癌的检出率。但影像学的诊断方法依赖于读片医师在形态学上的经验累积，存在很大的主观性，而且肺部器质性损伤需达到一定范围和程度才能确诊肺癌。所以，找到肿瘤相关的蛋白质特异性标志物会为肺癌的早期确诊提供客观准确的参考指标。本研究应用的SELDI技术是一种集分离、纯化和检测为一体的蛋白质组学技术，其特点是可以分析出小分子量(＜2500)、低浓度(fmol级)的蛋白质信息，尤其适用于筛选蛋白质生物标志物。目前，国内外已采用SELDI技术获得乳腺癌［3］、前列腺癌［4］、肾癌［5］等肿瘤标志物，且特异性和敏感性较强。

图2 鉴别肺癌患者、肺部良性肿瘤患者和正常对照者蛋白质谱差异表达的决策树模型当患者血清中的蛋白符合3318.57峰强度≤10.056且3246.34峰强度≤1.372且1929.70峰强度＞0.826，或者3318.57峰强度≤10.056且3246.34峰强度＞1.372，则被模型判断为肺癌;当患者血清中的蛋白符合3318.57峰强度＞10.056，或者3318.57峰强度≤10.056且3246.34峰强度≤1.372且1929.70峰强度≤0.826，则被模型判断为正常

关于SELDI技术用于肺癌方面的研究中，Simsek等［6］利用SELDI-TOF-MS技术对179例肺癌患者、53例肺癌高风险人群及47名健康者的血清进行检测，发现质荷比为11 547的蛋白质峰只出现在肺癌组中，但该研究并未将其用于判断肺癌患者的手术疗效。本研究发现在肺癌组中高表达的蛋白质峰11 508.90与Simsek等［6］研究中的11 547蛋白质峰相对分子质量接近，而且本研究发现它可进一步用于判断肺癌的治疗效果。金川等［7］用SELDI-TOF-MS技术检测患者化疗前后血清标本的蛋白质质谱，筛选出质荷比分别为7458.12、6598.64、4211.39和2258.31的4个血清标志物作为肺癌化疗疗效判定的候选指标。Jiang等［8］利用SELDI-TOF-MS技术对31例肺腺癌患者和31名健康者的血清进行检测，确定质荷比峰值为14 022.90和3735.99的蛋白，可用来构建分类树模型，并可对有效分离的肺腺癌患者进行健康控制管理。

本研究采用SELDI技术，对38例肺癌患者、12例肺部良性肿瘤患者和32名正常对照者的血清标本进行了蛋白质指纹图谱分析，并研究肺癌患者手术前后蛋白质谱表达的差异。通过对3组数据进行比较，采用BPS软件分析出6个蛋白质峰有显著差异，其相应的质荷比分别为1115.37、1929.70、3217.57、3246.34、3318.57、11 508.90。接下来以这6个差异表达显著的蛋白峰为依据，建立了分类决策树模型，并分出4个终节点。决策树模型对肺癌的原始判别敏感性为92.11%，特异性为90.91%;交叉验证敏感性为86.67%，特异性为86.67%。进一步研究发现，在肺癌患者手术前后的对比中，这6个蛋白峰也有显著差异。其中1115.37、1929.70、3246.34和11 508.90在肺癌患者中明显升高，且肺癌患者治疗后表达量明显降低，说明这4个蛋白质峰在肺癌的诊断及疗效判定方面，具有良好的临床应用前景。而3217.57和3318.57在肺癌患者中明显降低，当肺癌患者治疗后进一步下降，表明这2个蛋白质峰的下降对肺癌的诊断可能有帮助。对于筛选出的差异蛋白，笔者推测其蛋白性质有以下几种可能:(1)肿瘤细胞表达的特异性蛋白质分子;(2)肿瘤状态下人体免疫系统产生的非特异性炎性反应蛋白质分子;(3)肿瘤状态下人体免疫系统产生的特异性炎性反应蛋白质分子。实验结果可为今后疾病早期诊断及疗效评估提供依据。

本研究共纳入82例样本，最终应用于临床筛查尚需更多的多中心大样本临床试验来反复验证并进一步完善。虽然本研究尚未阐明筛选出的蛋白质峰对应的多肽及其生物学效应，有待进一步后续研究验证，但本研究结果为肺癌的早期诊断提供了敏感性和特异性较高的生物学标志物，并可用于判断肺癌的手术疗效。这为肺癌的早期诊断和疗效的判定提供了广阔的前景。

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Early Detection of Serum Protein Biomarker of Lung Cancer by Surface-enhanced Laser Desorption/ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Combining with Magnetic Bead

XIE Jing1，ZHU Qian-kun2，ZHU Li-si2，XIAO Ke2，ZHU Wei2，ZHUGE Si-liang2，ZHU Zhao-hui3，WU Zhi-hong1
1Department of Center Laboratory，2Department of Orthopedics，3Department of Nuclear Medicine，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100730，China

s:ZHU Zhao-huiTel:010-69155512，E-mail:13611093752@163．com

ObjectiveTo establish the diagnostic model for lung cancer by protein fingerprint techniques and to further explore the serum protein biomarker for early diagnosis and surgical effect assessment of lung cancer．MethodsSerum samples from 32 healthy controls，38 lung cancer patients，and 12 lung benign tumor patients were analyzed by surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(SELDI-TOF-MS)combining with magnetic bead technique to establish proteomic spectra．The data were categorized and analyzed with Biomarker Patterns Software(BPS)to develop a preliminary diagnostic model of serum protein fingerprint of lung cancer．Efficiency of this diagnostic model was tested．Combining with the diagnostic model，the proteomic spectra before and after surgery were compared to identify the proteins suitable as indicators of surgical effect．ResultsWithin the mass-to-charge ratio(m/z)range of 1000－50 000，215 protein peaks were detected and marked in the enrolled patients and healthy controls．Of these protein peaks，6 peaks were identified as showing statistically significant difference in expression(m/z 1115.37，1929.70，3217.57，3246.34，3318.57，11 508.90，P＜0.05)．The primary sensitivity for diagnosing lung cancer was 92.11%(35/38)and its corresponding specificity was 90.91%(40/44)．The cross validation suggested that the sensitivity and specificity were both 86.67% (13/15)．The protein peaks with m/z being 1115.37，1929.70，3246.34，and 11508.90 were significantly increased in lung cancer patients(P＜0.05)，and significantly reduced after surgery compared with before surgery in these patients(P＜0.01)，suggesting potential value of these 4 protein peaks in diagnosis and treatment effect assessment of lung cancer．ConclusionThe serum protein fingerprint diagnostic model for lung cancer based on SELDI-TOF-MS technique yields fairly high sensitivity and specificity，which may provide innovative thoughts for identification of biomarker for early diagnosis and treatment effect assessment of lung cancer．

lung cancer;tumor markers;diagnosis;proteomics;surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry

朱朝晖电话:010-69155512，E-mail:13611093752@163．com

吴志宏电话:010-69154259，E-mail:wuzh3000@126．com

R736.3;R365

A

1674-9081(2016)06-0416-05

10.3969/j.issn.1674-9081.2016.06.003

WU Zhi-hongTel:010-69154259，E-mail:wuzh3000@126．com

2015-10-20)